牙周炎患者龈下菌斑菌群的高通量测序分析

杨万娟， 徐杰

昆明医科大学附属口腔医院牙周病科，云南 昆明（650106）

常见的牙周炎有慢性牙周炎（chronic periodon⁃titis，CP）和侵袭性牙周炎（aggressive periodontitis，AgP）等。当CP 发展至重度慢性牙周炎（severe chronic periodontitis，SCP）时，牙周支持组织破坏严重，并伴有多种并发症；广泛型侵袭性牙周炎（gen⁃eralized aggressive periodontitis，GAgP）患者由于病程进展快，就诊时通常也存在严重的牙周支持组织破坏，伴多种并发症；临床表现的相似性使SCP和GAgP 在鉴别诊断方面存在一定的局限性。

牙周炎是感染性疾病，随着牙周炎的进展，龈下菌群的多样性也会增加［1⁃2］。因此菌斑生物膜中相关微生物的检测是研究病因学的重要手段［3］。常见的牙周微生物检测技术包括细菌培养法、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）及DNA 探针等技术。它们能对牙周致病菌进行定性及定量研究，但是能一次性同时检测的细菌数量有限，在菌群研究方面存在局限性。

近年来，研究者将高通量测序（high⁃throughput sequencing，HTS）技术用于牙周炎相关微生物的研究，并取得了一定的进展。该技术能够进行大规模并行测序，具有高通量、高效率和高准确度的优势，能够对牙周微生物群落的组成、多样性、菌群关系及群落功能等多方面信息展开研究［4］。因此本研究选择以GAgP 与SCP 患者为研究对象，利用HTS 检测上述两种疾病龈下菌群的组成和多样性等信息，并观察基础治疗前后两者龈下菌群的变化。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择2018 年9 月至2019 年5 月在昆明医科大学附属口腔医院牙周病科就诊的11 例GAgP 患者和14 例SCP 患者。其中GAgP 患者年龄21～32 岁，平均（26.16 ± 4.40）岁，男性4 例，女性7 例；SCP 患者年龄36～64 岁，平均（44.36 ± 8.51）岁，男性8例，女性6 例。诊断标准严格按照1999 年牙周病分类国际研讨会所制定的标准。所有患者试验前均签署知情同意书。纳入标准如下：①GAgP 患者年龄不超过35 岁，全口至少有6 颗取样患牙，探诊深度（probing depth，PD）≥ 6 mm，临床附着丧失（clinical attachment loss，CAL）≥5 mm，X 线片显示有邻面牙槽骨吸收，无明显的咬合关系异常，未接受正畸治疗；②SCP 患者年龄35 岁以上，全口至少有6 颗取样患牙，PD ≥6 mm，CAL ≥5 mm，牙槽骨吸收超过根长的1/2；③半年内未进行过任何牙周治疗；④3 个月内未使用过抗生素或非甾体类抗炎药；⑤至少有20 颗天然牙，且每个象限都余留有天然牙；⑥同意参加此项研究。排除标准如下：①妊娠及哺乳期妇女；②患有糖尿病、心血管疾病和血液性疾病等系统性疾病者；③吸烟者。

1.2 牙周检查及治疗

记录纳入病例PD、CAL 和探诊出血等指标，进行牙周基础治疗，包括龈上洁治、龈下刮治、根面平整和口腔卫生指导。牙周基础治疗的方法：使用瑞士EMS 牙周治疗仪进行龈上洁治，龈下刮治、根面平整及抛光，同时进行口腔卫生指导，1 周后复诊再次清理残余牙石。龈上洁治效果是肉眼看不到牙石和色素，龈下刮治及根面平整效果是探诊根面光滑平整，无残余牙石。

1.3 样本采集及基因组DNA 提取

在基线及牙周基础治疗后第6 周分别采集龈下菌斑，两次采集位点相同，共采集50 个样本。GAgP 基线时样本记为QA 组，牙周治疗后第6 周样本记为QB 组；SCP 基线时样本记为MA 组，基础治疗后第6 周样本记为MB 组。将患者口腔分为6 个区段，采集每个区段内PD 最深位点的龈下菌斑。去除龈上菌斑，Gracey 刮治器采集龈下菌斑，并将6 个位点的集合菌斑迅速置入1 个装有750 μl 灭菌TE 缓冲液的1.5 ml EP 管，-80 ℃冰箱保存备用。使用微量样品基因组DNA 提取试剂盒（天根公司，中国）提取龈下菌斑样本中的基因组DNA，并用超微量紫外分光光度计测定DNA 纯度和浓度。

1.4 样本前处理及高通量测序

使 用 引 物515f 和806r 扩 增16s rDNA 的V4 高变 区。第 一 轮PCR 反 应 体 系：2 × High⁃Fidelity Master Mix 12.5 μL、PE1⁃515f（10 μM）0.25 μL、PE2⁃806r（10 μM）0.25 μL、Template DNA 3 μL、ddH2O 25 μL；循环条件：94 ℃预变性3 min；15 个循环（94 ℃，45 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s）；72 ℃延伸5 min。第 二 轮PCR 反 应 体 系：PE1.0⁃L（100 μM）0.15 μL、index primer（10 μM）1.5 μL；循环条件：98 ℃预变性1 min；15 个循环（98 ℃，10 s；56 ℃，20 s；72℃，20 s）；72 ℃延伸5 min 。PCR 产物进行1%琼脂糖电泳，150 V、100 mA 电泳观察20 min，切割目的条带并纯化，BioTek 酶标仪定量，Illumina MiSeq 平台进行高通量测序。

1.5 生物信息学分析

利 用QIIME（quantitative insights in microbial ecology）、Mothur 以及SPSS（26.0 版本）等软件对原始数据去杂得到优化序列，根据97%相似度对优化序列进行可操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类，选择每个OTU 中丰度最高的序列作为OTU 的代表序列，将OTU 代表序列与物种分类数据库作比对，注释样品中的物种信息，绘制相对丰度柱状图和热图；计算菌群丰度指数以及菌群多样性指数（Shahnon、Simpson 指数），绘制稀释曲线，通过t检验、non⁃parametric factorial Kruskal⁃Wallis sum⁃rank 检验及皮尔逊系数函数对群落进行α 多样性分析与β 多样性分析，绘制主坐标分析（principal coordinates analysis，PCoA）图；进行LEfSe差异分析（linear discriminant analysis effect size）、Network 网络分析以及使用KEGG PATHWAY 数据库（https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）对群落功能进行预测。检验水平为双侧α＝0.05。

2 结 果

2.1 龈下菌斑菌群相对丰度

本次测序50 个样本共获得19 580 817 条原始序列，经过滤最终获得19 302 060 条高质量序列，按97%相似度进行聚类得到2 364 个OTU，与数据库比对注释到19 门，38 纲，64 目，112 科，209 属，125 种。门、属和种三个水平的优势菌在各组中的相对丰度见图1。属水平的相对丰度热图见图2，其中卟啉单胞菌属和密螺旋体属等主要分布于GAgP 和SCP 基线样本中，放线菌属和罗氏菌属等主要分布在GAgP 和SCP 治疗后第6 周的样本中。

2.2 α 多样性分析

基线时GAgP 和SCP 的Shannon 指数和Simpson指数无统计学差异（P＞0.05，表1）；治疗后第6 周，两者的Shannon 指数和Simpson 指数均降低，其中SCP 的Shannon 指数降低有统计学意义（P＜0.05，表2）。随着测序深度增加，当序列数超过50 000 时，说明此次测序量已经足够覆盖所有菌种（图3）。

2.3 β 多样性分析

如图4 所示，QA 组和MA 组距离近，说明基线时GAgP 和SCP 龈下菌群相似；QB 组和MB 组距离接近，但与QA 组和MA 组分开，说明治疗后第6 周GAgP 和SCP 龈下菌群相似，但与基线不同。与QA组和MA 组内各样本间距离相比，QB 组和MB 组内各样本间距离稍分散，说明治疗后第6 周龈下菌群变化因个体差异稍有不同。

Figure 2 Relative abundance heatmap in genus level in GAgP group and SCP group before and after treatment图2 GAgP 组与SCP 组治疗前后属水平相对丰度热图

表1 GAgP 和SCP 基线时α 多样性指数Table 1 The α diversity index of GAgP and SCP at baseline

表2 GAgP 和SCP 基础治疗前后α 多样性指数Table 2 The α diversity index of GAgP and SCP before and after initial therapy

2.4 LEfSe 差异分析

LEfSe 分析用于寻找各组间具有统计学差异的生物标志物，如图5，在门、纲和目水平，放线菌在GAgP 治疗后第6 周增加，且线性判别分析分值（LDA score）大于5，说明放线菌是GAgP 治疗后显著增加的细菌。

2.5 Network 网络分析

网络图可以研究细菌与细菌之间的关系，网络中两个图标距离越近，说明它们越相关。如图6，本实验共发现10 个紧密联系的细菌关系网络，小杆菌属、产线菌属及密螺旋体属等33 个菌属构成最大的关系网络，二氧化碳噬纤维菌属、链球菌属及金氏菌属等19 个菌属构成第二大关系网络，这两大关系网络均有链球菌属参与。

2.6 群落功能预测

Figure 3 Rarefaction curve图3 稀释曲线

本次测序通过KEGG PATHWAY 数据库（https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）对群落功能进行预测，未发现GAgP 和SCP 龈下菌群间存在显著差异的群落功能，差异主要体现在GAgP 和SCP治疗前后，GAgP 预测到62 种功能在治疗后第6 周发生改变（P＜0.05），SCP 预测到38 种群落功能在治疗后第6 周发生改变（P＜0.05）；其中与氨基酸代谢、甲烷代谢和肽酶等相关的功能降低（群落功能预测图见本文OSID 码）。

3 讨 论

3.1 龈下菌群的组成和结构分析

基线时，GAgP 和SCP 的优势菌在门、属和种水平均无明显差异。优势菌门和优势菌属与Han等［5］和Tsai 等［6］的研究一致，包括拟杆菌门、梭杆菌门和卟啉单胞菌属等。优势菌种包括牙髓卟啉单胞菌、直肠弯曲菌和索氏密螺旋体等，未检出牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体等常见的代表菌种，此结果与Szafranski 等［7］的研究结果不完全相同，分析这一现象与测序选择扩增的16s rDNA 高变区不同有关。Szafranski 等［7］扩增的是V1⁃V2 和V5⁃V6 高变区，结果可检测到牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体等常见的牙周致病菌，本实验扩增的是V4 高变区，故检出的是大量的牙髓卟啉单胞菌。该结果说明龈下菌群组成结构复杂多样，除了常见的牙周致病菌外，还有许多其他细菌发挥着重要作用，而HTS 有助于发现更多的菌群。16s rDNA 高变区的选择还与测序平台有关，本实验使用的Illumina MiSeq 平台测序成本相对较低，测序深度也较深［8］，V3～V4 区是该平台经常选择的区域，故产生上述差异。治疗后第6 周，GAgP 和SCP龈下菌群变化趋势相似，拟杆菌门和卟啉单胞菌属等相对丰度降低，放线菌门和链球菌属等相对丰度增加，与之前的研究结果相同。

LEfSe 分析强调统计学意义和生物相关性，能够在组与组之间寻找具有统计学差异的生物标志物［9］。Szafranski 等［7］通过LEfSe 分析发现牙周炎患者与牙周健康者的生物标志物不同。本实验未发现GAgP 和SCP 间存在差异性生物标志物，而在GAgP 患者治疗后第6 周的龈下菌群中发现，放线菌在门、纲、目水平显著增加。放线菌是牙周健康者富集的细菌［6］，本次结果提示可将其作为判断GAgP 患者预后的潜在微生物标志物。AgP 常与伴放线聚集杆菌（Actinobacillus actinomycetemcomi⁃tans，Aa）存在高度相关。本实验未发现Aa，与Schulz 等［2］的结果一致，分析原因如下：①不同的地区人种会影响Aa的检出率，非洲及中东等地区的AgP 患者中Aa检出率较亚洲等地高［10］，Aa中毒性较高的JP2 基因型也多分布在非洲等地［11］，本实验的研究对象均为亚洲人，故未检测到Aa；②Aa的定植常发生在青少年时期，且多导致典型的局限型侵袭性牙周炎［10］，本实验的研究对象是平均年龄（26.18 ± 4.40）岁的GAgP 患者，多处于晚期重度，也可能影响Aa的检出。

3.2 群落多样性分析

本实验中，GAgP 与SCP 基线时α 多样性指数无统计学差异，基础治疗后第6 周，Shannon 指数和Simpson 指数降低，说明基础治疗可以降低龈下菌群的多样性，Campisciano 等［12］的研究也说明非手术治疗后龈下菌群的α 多样性降低。本实验β 多样性分析显示基线时GAgP 和SCP 龈下菌群的组成结构相似，但治疗后第6 周菌群变化存在个体差异，与Schwarzberg 等［13］的结果相似。基础治疗后牙周袋变浅，此时的龈下菌群更易受口腔卫生和饮食等个体因素的影响；Chen 等［14］通过评估口腔微生物群落迁移的生态过程发现，个体内微生物群落的均质化扩散作用比个体间明显，这一作用导致个体内不同位点的菌群更加相似，而个体间的菌群存在差异。群落多样性分析提示龈下菌斑控制的重要性，龈下菌斑生物膜是有序排列的建筑式样结构，多样性高在一定程度上意味着龈下菌群间联系紧密，丰富度越高，微生态系统更稳定。因此充分去除生物膜有利于牙周健康，尤其对于牙周炎患者来说，预防龈上菌斑的堆积可以延缓龈下菌斑生物膜的重新定植［15］，这也是牙周维护治疗的重要意义。

Figure 5 LEfSe analysis of the changes of subgingival microbiota in GAgP group before and after treatment图5 GAgP 组治疗前后菌群变化的LEfSe 差异分析

3.3 龈下菌群相关性分析

本实验通过Network 网络分析发现10 个相互联系的细菌网络，其中最大的关系网络包括小杆菌属、产线菌属及密螺旋体属等33 种菌属，它们大多是与牙周炎相关的菌属，与Chen 等［14］的研究结果相同；第二大关系网络包括二氧化碳噬纤维菌属、链球菌属及金氏菌属等19 种菌属，它们大多是与牙周健康相关的菌属。在上述两大关系网络中，链球菌属均有参与，提示链球菌属在龈下菌群由健康向失调转变的过程中可能发挥着重要作用。

Figure 6 Network analysis of genus level correlation图6 属水平物种相关性网络分析

在健康人口腔中，链球菌是正常菌群，它与多种菌群密切联系并维持口腔菌群的稳定［16］。在菌斑生物膜形成的过程中，链球菌是早期定植者，它可以通过黏附素⁃受体作用机制直接黏附定植到获得性薄膜上，为其他细菌提供新的结合位点［17］，从而介导其他口腔细菌的定植，最终形成复杂稳定的生物膜群落。在细菌定植的过程中，龈下菌群经历了三个阶段的演变：健康菌群阶段、健康菌群和牙周炎相关菌群组成的多样化菌群阶段、以牙周致病菌为主的菌群阶段，这一演变过程提示及时阻断由早期定植者介导的菌群演变的重要性。然而口腔是一个有菌环境，链球菌作为口腔正常菌群的一员，在维护口腔健康方面发挥着重要作用，正确的治疗理念是维持菌群平衡，因此对患者进行口腔卫生指导显得尤为重要。每日进行有效的菌斑控制，能够在菌斑生物膜形成早期将其清除，避免菌群演变导致菌群失调而引发牙周炎，对牙周炎的预防和疗效维护有重要意义。

除了上述最大的两个关系网络外，本实验还发现了分别以出芽菌属、沙雷氏菌属、微杆菌属、Anaerococcus、Nicoletella、甲烷短杆菌、巴拿马草属及Dermacoccus为代表的8 个关系网络，其中与牙周炎相关的致病菌聚集杆菌属和巴氏杆菌属、Ni⁃coletella及Bibersteinia相互联系，但关于这些菌属之间的具体关系以及它们与牙周炎的关系暂未有相关研究报道，有待进一步的研究。基于菌属间相关性的网络分析可以在复杂的龈下菌群中尽可能发现更多相互联系的菌属，虽然不能明确具体的关系是协同或者拮抗，但能为今后验证细菌之间具体的相互作用提供方向。

3.4 群落功能预测

HTS 不仅能分析菌群的组成和结构，还可以进行群落功能预测，了解群落中细菌的代谢功能有助于理解菌群的致病机制［18］。本实验未发现基线时GAgP 和SCP 的龈下菌群间存在显著差异的群落功能，但牙周基础治疗后第6 周，GAgP 的龈下菌群中预测到62 种功能发生改变，SCP 的龈下菌群中预测到38 种功能发生改变，其中与氨基酸代谢、甲烷代谢和肽酶等相关的功能降低，表明此时龈下菌群中的代谢活动受到影响，这可能与牙周基础治疗后龈下菌群的丰富度和多样性降低有关。牙周基础治疗可以扰乱龈下微生态系统，龈下菌群的新陈代谢活动会受到干扰。Kirst 等［19］通过测序发现CP 患者的龈下菌群中与能量代谢、甲烷代谢和肽酶等相关的功能比牙周健康者更为丰富，而本实验发现牙周基础治疗后上述功能降低，间接说明能量代谢、甲烷代谢和肽酶等细菌代谢功能与牙周炎有关。虽然具体作用机制不明确，但HTS可以同时对龈下菌群中的多种代谢功能进行预测，在此基础上筛选出关键功能，对今后的针对性研究具有一定的意义。

4 小 结

综上所述，本研究通过HTS 分析了GAgP 和SCP 患者龈下菌群的组成、多样性、菌群关系及群落功能等信息，并观察了牙周基础治疗前后的菌群变化，结果显示GAgP 和SCP 的龈下菌群相似，牙周基础治疗可以改变龈下菌群组成和结构，降低群落多样性，降低氨基酸代谢、甲烷代谢和肽酶等群落功能。链球菌属在龈下菌群由健康向失调转变的过程中可能发挥着重要作用。不足之处：本实验只观察了牙周基础治疗后第6 周龈下菌群的变化，未进行远期效果的观察，今后应延长追踪时间，观察远期效果；在进行高通量测序时，本实验只选择了16s rDNA 的一个高变区进行扩增，在细菌种水平上的鉴定不够完善，在今后的实验中应在测序平台读长允许的条件下选择多个高变区组合进行测序。

【Author contributions】Yang WJ performed the experiments, ana⁃lyzed the data and wrote the article. Xu J designed the study. All au⁃thors read and approved the final manuscript as submitted.