基于NaCl重吸收抑制作用的石韦利尿活性成分筛选

隋 怡，滕明刚，罗国勇，柴慧芳，龙 毅，杨武德

基于NaCl重吸收抑制作用的石韦利尿活性成分筛选

隋 怡，滕明刚，罗国勇，柴慧芳，龙 毅，杨武德*

贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025

建立基于抑制NaCl重吸收作用的利尿药物体外筛选模型，研究21个从石韦中分离的化合物的利尿活性，并通过体内实验进行验证。采用犬肾小管上皮细胞MDCK对石韦中21个化合物进行体外利尿活性筛选，确定NaCl体外转运实验的最佳NaCl剂量；将MDCK细胞接种于Transwell小室内，设置对照组、石韦化合物（100 μmol/L）组、氢氯噻嗪（100 μmol/L）组，给药孵育24 h后，加入NaCl溶液（15 mg/mL），于30 min、2 h、4 h分别取Transwell下室培养液，检测Cl−和Na＋吸光度。昆明小鼠随机分为对照组、绿原酸甲酯（10 mg/kg）组、山柰酚（10 mg/kg）组、氢氯噻嗪（10 mg/kg）组，给予药物干预5 d后，检测各组小鼠5 h内的尿量。与对照组比较，加入NaCl 30 min，氢氯噻嗪组MDCK细胞Cl−和Na＋水平显著降低（＜0.05），绿原酸甲酯组MDCK细胞Na＋水平显著降低（＜0.05）；加入NaCl 2 h，绿原酸甲酯组MDCK细胞Cl−水平显著降低（＜0.05）。与对照组比较，绿原酸甲酯组和氢氯噻嗪组小鼠给药后5 h内的总尿量显著增加（＜0.05）；氢氯噻嗪组和绿原酸甲酯组小鼠尿量峰值分别为给药后1.5、2.5 h，随后尿量均呈下降趋势。绿原酸甲酯可抑制肾小管氯化钠转运，对小鼠具有利尿作用，是石韦中的利尿活性成分。

活性筛选；利尿；石韦；绿原酸甲酯；重吸收

利尿药是一类能够促进机体水分排出从而使尿量增加的药物，临床上常用于治疗水肿、高血压等[1]。石韦为水龙骨科植物庐山石韦(Bak.) Ching、石韦(Thunb.) Farwell或有柄石韦(Christ) Ching的干燥叶，具有利尿通淋、清肺止咳、凉血止血的功效，主治热淋、血淋、石淋等症[2]。课题组前期从石韦中提取并分离出里白烯、β-谷甾醇、绿原酸、芒果苷、异芒果苷、槲皮素、异槲皮素、蔗糖等21个化合物[3]，但其利尿通淋的活性成分尚不明确。传统的利尿药物筛选方法多为体内实验，实验周期长且不适用于批量化合物的筛选。本研究采用Transwell小室模拟肾小管，建立Transwell小室内外NaCl浓度差，探究具有抑制NaCl转运作用的化合物，从而筛选出具有抑制肾小管细胞转运NaCl作用的化合物；并通过体内实验验证化合物的利尿作用，为石韦利尿通淋的机制奠定基础。

1 材料

1.1 细胞

犬肾小管上皮细胞MDCK购自中国科学院上海细胞库。

1.2 动物

清洁级成年雄性昆明种小鼠，体质量18～22 g，购自重庆腾鑫有限公司，合格证号SCXK（辽）2015-0001。于温度22～25 ℃、相对湿度50%～60%下，自由进食饮水。动物实验遵循贵州中医药大学有关实验动物管理和使用的规定，均符合3R原则。

1.3 药材

黔产有柄石韦（批号20160625）由龙里县湾滩河镇弯寨石头村李红提供，经贵州中医药大学生药教研室周汉华教授鉴定为水龙骨科植物有柄石韦(Christ) Ching的干燥叶。

1.4 药品与试剂

氢氯噻嗪片剂（批号20180324，规格25 mg/片）购自常州制药厂有限公司；NaCl（批号20150928）购自天津市富宇精细化工有限公司；Cl−、Na＋检测试剂盒（批号分别为20190628、20190625）购自南京建成生物工程研究所；胎牛血清（货号11011-8611）购自浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM高糖培养基（货号C11995500BT）购自美国Gibco公司；磷酸盐缓冲液（货号02-024-1ACS）、青霉素-链霉素溶液（货号03-031-1B）、胰酶（货号03-050-1B），均购自以色列BI公司。

1.5 仪器

双人超净工作台（苏州净化设备有限公司）；CO2培养箱（日本三洋电器股份有限公司）；倒置相差显微镜（日本尼康）；自动酶标读仪（美国Bio-Tek公司）；Millicell-ERS-2型细胞电阻仪（美国Millipore公司）。

2 方法

2.1 石韦中化合物的分离

课题组前期从黔产有柄石韦中提取并分离的21个化合物见表1，质量分数均大于96%[2]。

表1 从有柄石韦中分离的化合物信息

2.2 MDCK细胞的培养

MDCK细胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM高糖培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

2.3 药物的配制

NaCl溶于DMEM培养基，分别配制成质量浓度为12、15、18、21、24、27、30、33、36 mg/mL的溶液。表1中的化合物分别溶于DMEM培养基，配制成100 μmol/L的溶液。

2.4 NaCl体外转运实验剂量的筛选

取处于对数生长期的MDCK细胞，接种于96孔板。设置对照组和9个质量浓度（12、15、18、21、24、27、30、33、36 mg/mL）NaCl组，各组分别加入相应溶液，对照组加入生理盐水，培养8 h，MTT法检测细胞存活率，确定NaCl体外转运实验的最佳NaCl质量浓度。

2.5 石韦中分离的化合物对NaCl体外转运的影响

取处于对数生长期的MDCK细胞，以4×105/mL接种于Transwell小室内，下室加入1 mL培养基以适应细胞正常生长。细胞贴壁后，于37 ℃测定各孔细胞的电阻值[4]。取跨膜电阻值≥300 Ω·cm2的MDCK细胞，设置对照组、石韦中分离的不同化合物（100 μmol/L）组、氢氯噻嗪（100 μmol/L）组，各给药组加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。弃去Transwell小室内液体，加入NaCl（15 mg/mL）溶液继续培养，分别于30 min、2 h和4 h吸取50 μL下室中的液体，按照试剂盒说明书检测Cl−、Na＋的吸光度。

2.6 石韦中分离的化合物对小鼠的利尿作用

将小鼠随机分为对照组、绿原酸甲酯（10 mg/kg）组、山柰酚（10 mg/kg）组、氢氯噻嗪（10 mg/kg）组，每组7只。各给药组小鼠ig相应药物（20 μL/g），对照组ig等体积生理盐水，1次/d，连续5 d。给药结束后，各组小鼠ip 1 mL生理盐水，立即放入提前垫好3层滤纸的代谢笼中，每30分钟称定滤纸质量并更换，连续记录5 h内滤纸质量，并计算5 h内小鼠尿量。

2.7 统计学分析

3 结果

3.1 NaCl体外转运实验剂量的筛选

如图1所示，NaCl抑制MDCK细胞活力，呈剂量相关性。NaCl的质量浓度高于15 mg/mL，MDCK细胞存活率均低于50%。因此，选择15 mg/mL NaCl进行后续实验，孵育时间为4 h以内，该条件下既能使MDCK细胞两侧维持一定的NaCl质量浓度梯度，又不影响细胞活力。

3.2 石韦分离的化合物对Cl−和Na＋体外转运的影响

如表2所示，与对照组比较，加入NaCl 30 min，坝巴酸、(23)-cycloart-23-ene-3β,25-diol和氢氯噻嗪组MDCK细胞Cl−水平显著降低（＜0.05），Cl−跨细胞转运受到抑制；加入NaCl 2 h，绿原酸甲酯组MDCK细胞Cl−水平显著降低（＜0.05），Cl−跨细胞转运受到抑制。

图1 不同质量浓度的NaCl对MDCK细胞活力的影响()

与对照组比较，加入NaCl 30 min，绿原酸甲酯、氢氯噻嗪组MDCK细胞Na+水平显著降低（＜0.05），Na＋跨细胞转运受到抑制；加入NaCl 4 h，各组MDCK细胞Na＋水平均无明显差异。

3.3 石韦中分离的绿原酸甲酯和山柰酚对小鼠的利尿作用

如表3所示，与对照组比较，给药后第3小时内，绿原酸甲酯和氢氯噻嗪组小鼠尿量显著增加（＜0.05），2组无显著性差异；绿原酸甲酯和氢氯噻嗪组小鼠给药后5 h内的总尿量显著增加（＜0.05）。如图2所示，氢氯噻嗪组小鼠尿量在给药后1.5 h达到峰值，随后尿量呈下降趋势；绿原酸甲酯组小鼠尿量在给药后2.5 h达到峰值，随后尿量呈下降趋势；山柰酚组小鼠尿量在给药后2 h达到峰值。

4 讨论

尿液的生成和排出包括肾小球滤过和肾小管重吸收2个过程。重吸收是指肾小管上皮细胞将小管液原尿中的水分和某些溶质，部分或全部转运至血液。肾小球滤过的原尿中99%的水被重吸收[5-7]。目前大多数利尿药物如碳酸酐酶抑制剂、Na＋-Cl−协同转运体抑制剂、Na＋-K＋-2Cl−协同转运体抑制剂、阻断肾小管上皮Na＋通道药物、盐皮质激素受体阻断剂等均通过影响原尿重吸收从而发挥利尿作用[8-10]，其中以噻嗪类药物为代表的Na＋-Cl−协同转运体抑制剂和以呋塞米为代表的Na＋-K＋-2Cl−协同转运体抑制剂临床应用广泛[11-12]。因此，抑制肾小管NaCl的转运为影响利尿药物活性的重要机制。本研究采用接种MDCK细胞的Transwell小室模拟肾小管，筛选具有抑制肾小管NaCl转运作用的化合物。

NaCl体外转运实验结果显示，与对照组比较，加入NaCl 30 min，氢氯噻嗪组和绿原酸甲酯组MDCK细胞Cl−和Na＋转运被明显抑制，坝巴酸组和(23)-cycloart-23-ene-3β,25-diol组MDCK细胞Cl−转运被明显抑制；加入NaCl 2 h，绿原酸甲酯组MDCK细胞Cl−转运被明显抑制。表明坝巴酸、(23)-cycloart-23-ene-3β,25-diol和绿原酸甲酯是石韦中具有抑制Na＋和Cl−转运活性的化合物。

表2 不同时间点从石韦中分离的化合物对Cl−和Na＋体外转运的影响()

与同时间对照组比较：*＜0.05，下表同

*< 0.05control group at the same time, same as blow table

表3 石韦中分离的绿原酸甲酯和山柰酚对小鼠的利尿作用(，n = 7)

图2 石韦中分离的绿原酸甲酯和山柰酚对小鼠的利尿作用(，n = 7)

课题组前期对21个石韦化合物与Na＋-Cl−协同转运体激活的上游大分子[13-15]进行分子对接，发现山柰酚和绿原酸甲酯与赖氨酸蛋白缺乏激酶1（with no lysinekinase1，WNK1）具有良好的结合活性。因此，结合NaCl体外转运实验结果，考察山柰酚和绿原酸甲酯对小鼠的利尿作用，结果显示，绿原酸甲酯对小鼠具有显著的利尿作用，起效峰值在给药后3 h，且其5 h内的利尿作用与氢氯噻嗪无明显差异；山柰酚对小鼠具有一定的利尿作用，但其尿量与对照组比较无明显差异，其尿量峰值在给药后2 h，与NaCl体外转运实验结果一致。

综上，绿原酸甲酯具有良好的体内和体外利尿活性，与氢氯噻嗪疗效相当，是石韦的利尿活性成分，其利尿机制与抑制肾小管上皮细胞NaCl的重吸收作用有关。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Screening of active components frombased on inhibition of NaCl reabsorption

SUI Yi, TENG Ming-gang, LUO Guo-yong, CHAI Hui-fang, LONG Yi, YANG Wu-de

Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China

To establish anscreening model of diuretic drugs based on the inhibition of NaCl reabsorption, study and verify the diuretic activity of 21 compounds isolated from.Canine renal tubular epithelial MDCK cell was used to screen for diuretic activity of 21 compounds isolated fromto determine the optimal NaCl dose for the transport experiment of NaCl; MDCK cells were inoculated into Transwell chamber, and control group; Compound from(100 μmol/L) group and hydrochlorothiazide (100 μmol/L) group were set up, after 24 h of incubation, NaCl solution (15 mg/mL) was added, the Transwell lower chamber culture medium was respectively taken at 30 min, 2 h, and 4 h, and the Cl−and Na＋absorbance were measured. KM mice were randomly divided into control group, methyl chlorogenate (10 mg/kg) group, kaempferol (10 mg/kg) group, and hydrochlorothiazide (10 mg/kg) group. After drug intervention for 5 d, urine volume of mice in each group was tested within 5 h.Compared with control group, after adding NaCl for 30 min, the levels of Cl−and Na＋in MDCK cells of hydrochlorothiazide group were significantly reduced (< 0.05), and the levels of Na＋in MDCK cells in methyl chlorogenate group were significantly reduced (< 0.05); After adding NaCl for 2 h, the level of Cl−in MDCK cells in methyl chlorogenate group was significantly reduced (< 0.05). Compared with control group, the total urine output of mice in methyl chlorogenate group and hydrochlorothiazide group were significantly increased within 5 h after administration (< 0.05); The peak urine output of the mice in hydrochlorothiazide group and methyl chlorogenate group were respectively 1.5 h and 2.5 h after administration, the urine output showed a downward trend.Methyl chlorogenate, the diuretic active ingredient in, could inhibit the transport of sodium chloride in the renal tubules and has a diuretic effect on mice.

activity screening; diuretic;(Christ) Ching; methyl chlorogenate; reabsorption

R285.5

A

0253 - 2670(2021)04 - 1026 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.04.015

2020-10-10

国家自然科学基金资助项目（81660647）；大学生创新创业训练计划项目（201910662004）

隋 怡（1990—），女，硕士，助理实验师，从事中药药理和中药毒理学研究。E-mail: 836017075@qq.com

杨武德（1968—），男，教授。E-mail: 2994771096@qq.com

[责任编辑 李亚楠]