附子内生真菌Trichoderma sp. FZ-31的化学成分研究

陈小晶，朱丽君，段礼新，刘中秋，崔 辉，赵钟祥

附子内生真菌sp. FZ-31的化学成分研究

陈小晶，朱丽君，段礼新，刘中秋，崔 辉*，赵钟祥*

广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006

研究生附子内生真菌sp. FZ-31的化学成分。内生真菌发酵物采用正相硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱及制备型高效液相色谱等方法进行分离纯化，再通过核磁共振、质谱以及圆二色谱等方法鉴定单体化合物结构。从sp. FZ-31发酵产物的醋酸乙酯部位得到11个化合物，分别鉴定为(−)-蜂蜜曲菌素（1）、()-7-羟基蜂蜜曲菌素（2）、4-羟基蜂蜜曲菌素（3）、赤霉菌吡喃酮D（4）、阿魏酸甲酯（5）、吲哚-3-乙酸（6）、吲哚-3-甲醛（7）、苯甲酰胺（8）、(3,6)-4-甲基-6-(1-甲基乙基)-3-苯甲基全氢-1,4-噁嗪- 2,5-二酮（9）、酒渣碱（10）、腐皮壳素A（11）。除化合物5、7外，其余化合物均为首次从木霉菌sp.中分离得到，本研究为附子及其内生菌的开发利用提供了一定的研究基础。

附子；内生真菌；木霉菌；次生代谢产物；(−)-蜂蜜曲菌素；赤霉菌吡喃酮D；酒渣碱；腐皮壳素A

附子为毛茛科乌头属植物乌头Debx.子根的加工品，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛的功效[1]。现代药理研究发现，附子具有明显的强心、保护心肌、抗心律失常、抗炎、镇痛、增强免疫、抗肿瘤等功效[2]。

内生菌生活在健康的植物组织或细胞内，且不会引发宿主明显的感染症状。某些内生菌能产生和宿主相同或相似的化合物，或利用宿主的有效成分代谢出新的活性物质[3]。目前，乌头属植物内生菌的相关研究正在展开。艾嫦等[4]综述了从滇南黄草乌、川乌及乌头中分离鉴定了262株内生菌，且证实了大部分乌头内生菌具有抗菌活性。由此可见，筛选出能够产生活性代谢产物的菌种对于乌头属植物药用资源的开发具有重要意义。本研究对新鲜附子中的内生真菌进行分离，得到一株内生真菌并鉴定为木霉菌sp.，命名sp. FZ-31（菌种编号：MT889737）。木霉菌来源于半知菌亚门丝孢纲丝孢目，目前已鉴定出250余种[5]。大部分木霉菌可促进植物生长，提高植物的抗逆性和抗病性，是一类重要的生防微生物资源[6]。本实验从sp. FZ-31发酵产物的醋酸乙酯部位分离得到11个化合物（图1），分别鉴定为(−)-蜂蜜曲菌素 [(–)-mellein，1]、()-7-羟基蜂蜜曲菌素[()-7-hydroxymellein，2]、4-羟基蜂蜜曲菌素（4-hydroxymellein，3）、赤霉菌吡喃酮D（gibepyrone D，4）、阿魏酸甲酯（methyl ferulate，5）、吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，6）、吲哚-3-甲醛（indol-3-carbaldehyde，7）、苯甲酰胺（benzamide，8）、(3,6)-4-甲基-6-(1-甲基乙基)-3-苯甲基全氢- 1,4-噁嗪-2,5-二酮[(3,6)-4-methyl-6-(1-methylethyl)- 3-phenylmethylperhydro-1,4-oxazine-2,5-dione，9]、酒渣碱（flazine，10）、腐皮壳素A（diaporthein A，11）。除化合物5、7外，其余化合物均为首次从木霉菌sp.中分离得到。

图1 化合物1～11的结构

1 仪器与材料

HZP-250恒温培养摇床（上海精宏实验设备有限公司）；SW-CJ-2F单人单面超净台（南京贝登电子商务有限公司）；SQ5 10C高压灭菌锅（深圳市塞亚泰克仪器设备公司）；AB SCIEX Triple TOFTM 5600＋四级杆-飞行时间串联质谱（美国AB质谱公司）；Bruker AV超导核磁共振仪（400 MHz，瑞士布鲁克公司）；Chirascan圆二色谱仪（英国Applied Photophysics公司）；POLARTRONIC HH W5旋光仪（德国SCHMIDT＋HAENSCH公司）；SHIMADZU AUY12电子分析天平（岛津仪器公司）；LC-100半制备液相色谱仪（上海伍丰科学仪器有限公司）。

柱色谱硅胶（100～200、200～300目，青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶（日本GE医疗集团）；RP-C18硅胶（Fuji，40～75 mm，日本春日井富士硅业有限公司）；TLC分析硅胶板（GF254，德国默克公司）。甲醇（色谱级，北京迈瑞达科技有限公司）；石油醚、醋酸乙酯、三氯甲烷、甲醇（分析纯，天津致远试剂公司）。孟加拉红培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯葡萄糖水培养基（PDB），广东环凯微生物科技有限公司。

2 方法

2.1 植物材料来源

生附子于2018年12月采集于四川省大凉山布拖县好医生附子种植基地，由广州中医药大学段礼新研究员鉴定为乌头属植物乌头Debx.的子根，药材标本（FZ-201812）储存于广州中医药大学药学院中药化学教研室。

2.2 菌株的分离纯化

用清水洗净附子表面，在超净台中依次用0.5%次氯酸钠溶液和75%乙醇水进行表面消毒30 s，然后用无菌水冲洗，表面消毒完毕用灭菌小刀将药材切成厚度约2 mm的薄片，薄片接种于孟加拉红培养基中。培养基于室温下培养，待生长出菌落后于PDA培养基中进行纯化及保存。

2.3 菌种的鉴定

纯化后的菌株进行基因测序，将其18S rRNA基因序列提交至NCBI的GenBank基因库，进行BLAST比对，结果显示，该菌株与木霉菌sp.相似度达到99.94%，故鉴定该菌为木霉菌，命名为sp. FZ-31（菌种编号：MT889737）。该菌种现保存于广州中医药大学中药学院微生物库。

2.4 菌株发酵

用接种环挑取适量菌丝接种至装有200 mL PDB的三角瓶中，在恒温培养摇床中培养3 d（28 ℃，130 r/min），得到菌株种子液。将等量种子液（2 mL/瓶）接种至无菌大米培养基（60 g/瓶）中，共培养60瓶，室温下发酵培养30 d，得到固体发酵物。

2.5 发酵物分离纯化

发酵物用甲醇渗漉提取3次，渗漉液合并浓缩得到粗提物，粗提物用适量超纯水分散后用醋酸乙酯萃取3次（3×4 L），减压除去溶剂得浸膏46.2 g。浸膏经硅胶柱色谱，石油醚-醋酸乙酯（100∶1～0∶1）梯度洗脱，根据薄层色谱（TLC）检测后合并，共得到10个组分（Fr. 1～10）。Fr. 8（1.8 g）析出黄色粉末，经二氯甲烷-甲醇重结晶得化合物10（33.9 mg）。Fr. 1（0.2 g）经Sephadex LH-20柱色谱（二氯甲烷-甲醇 1∶1），根据TLC检测后合并，得到Fr. 1-1和Fr. 1-2，Fr.1-2（88.4 mg）中析出白色片状结晶，得化合物1（29.8 mg）。Fr. 3（0.2 g）采用制备型HPLC进一步分离[甲醇-水（50∶50），1.5 mL/min]，得化合物4（31.9 mg）。Fr. 4（0.8 g）采用制备型HPLC分离[甲醇-水（40∶60），1.5 mL/min]，得化合物2（12.3 mg）和3（15.2 mg）。Fr. 5（2.2 g）经ODS柱色谱，甲醇-水（40∶60～100∶0）梯度洗脱，根据TLC检测后合并，得Fr. 5-1～5-4。Fr. 5-3经Sephadex LH-20[二氯甲烷-甲醇（1∶1）]进一步纯化，得到化合物5（23.0 mg）。Fr. 5-4采用制备型HPLC进一步分离[甲醇-水（80∶20），1.5 mL/min]，得化合物6（10.4 mg）和7（13.9 mg）。Fr. 6（19.6 g）经硅胶柱色谱，石油醚-醋酸乙酯（5∶1～0∶1）梯度洗脱，根据TLC检测后合并，得2个组分Fr. 6-1和Fr. 6-2。Fr. 6-2（15.1 g）经ODS 柱色谱，甲醇-水（30∶70～100∶0）梯度洗脱，根据TLC检测后合并，得Fr. 6-2-1（6.8 g）和Fr. 6-2-2（7.2 g）。Fr. 6-2-2中析出白色结晶，经二氯甲烷-甲醇重结晶得化合物11（22.6 mg）。Fr. 6-2-1采用制备型HPLC进一步分离[甲醇-水（75∶25），1.5 mL/min]，得化合物8（12.1 mg）和9（17.3 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：白色结晶（甲醇），分子式为C10H10O3；HR-ESI-MS/: 179.070 0 [M＋H]+（C10H11O3，计算值179.070 3）；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 11.02 (1H, brs, 8-OH), 7.40 (1H, m, H-6), 6.69 (1H, d,= 8.4 Hz, H-7), 6.88 (1H, d,= 7.2 Hz, H-5), 2.92 (2H, m, H-4), 4.7 (1H, m, H-3), 1.53 (3H, s, 3-CH3)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 170.1 (C-1), 162.3 (C-8), 139.5 (C-10), 136.1 (C-6), 118.0 (C-7), 116.3 (C-5), 108.4 (C-9), 76.2 (C-3), 34.7 (C-4), 20.9 (3-CH3)。以上数据与文献报道基本一致[7]，故鉴定化合物1为(–)-蜂蜜曲菌素。

化合物2：白色粉末，分子式为C10H10O4；UV （MeOH）maxnm (log ε): 348 (3.414), 251 (3.461)；ECD（MeOH）max(Δε) 289 (＋28.552), 259 (−0.007), 219 (＋0.028) nm；HR-ESI-MS/: 193.050 64 [M－H]−（C10H9O4，计算值193.050 6）；1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.04 (1H, d,= 8.4 Hz, H-6), 6.70 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5), 4.70 (1H, m, H-3), 3.20 (1H, m, H-4a), 2.66 (1H, m, H-4b), 1.52 (3H, s, 3-CH3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 171.7 (C-1), 156.4 (C-8), 147.0 (C-7), 125.9 (C-6), 125.1 (C-5), 116.5 (C-10), 109.3 (C-9), 77.7 (C-3), 29.4 (C-4), 21.1 (3-CH3)。以上数据与文献报道基本一致[8]，故鉴定化合物2为()-7-羟基蜂蜜曲菌素。

化合物3：白色粉末，分子式为C10H10O4；UV （MeOH）maxnm (log ε): 312 (3.372), 244 (3.452); ECD（MeOH）max(Δε) 309 (＋0.034), 255 (−0.005), 219 (＋0.028) nm；HR-ESI-MS/: 193.050 7 [M－H]−（C10H9O4，计算值193.050 6）；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 10.96 (1H, brs, 8-OH), 7.53 (1H, t,= 7.9 Hz, H-6), 6.99 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5), 6.92 (1H, d,= 7.2 Hz, H-7), 4.60 (1H, d,= 6.4 Hz, H-3), 4.55 (1H, s, H-4), 1.56 (3H, d,= 6.8 Hz, 3-CH3)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 169.4 (C-1), 162.1 (C-8), 140.6 (C-10), 136.9 (C-6), 118.6 (C-5), 118.5 (C-7), 106.9 (C-9), 78.4 (C-3), 67.3 (C-4), 16.1 (3-CH3)。以上数据与文献报道基本一致[9]，故鉴定化合物3为4-羟基蜂蜜曲菌素。

化合物4：白色结晶（甲醇），分子式为C10H10O4；HR-ESI-MS/: 195.064 7 [M＋H]+（C10H11O4，计算值195.065 2）；1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.37 (1H, m, H-4), 6.67 (1H, d,= 7.0 Hz, H-5), 6.59 (1H, s, H-8), 2.08 (3H, d,= 1.2 Hz, 7-CH3), 2.34 (3H, d,= 1.3 Hz, 3-CH3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 164.2 (C-2), 128.1 (C-3), 141.2 (C-4), 107.3 (C-5), 158.5 (C-6), 143.7 (C-7), 120.0 (C-8), 169.3 (9-COOH), 16.7 (7-CH3), 13.5 (2-CH3)。以上数据与文献报道基本一致[10]，故鉴定化合物4为赤霉菌吡喃酮D。

化合物5：白色粉末，分子式为C11H12O4；HR-ESI-MS/: 207.066 3 [M－H]–（C11H11O4，计算值207.066 3）；1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 9.61 (1H, brs, 4-OH), 7.55 (1H, d,= 16.0 Hz, H-7), 7.30 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 7.12 (1H, dd,= 2.0, 1.6 Hz, H-6), 6.80 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 6.47 (1H, d,= 16.0 Hz, H-8), 3.70 (3H, s, 9-OCH3), 3.80 (3H, s, 3-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 167.2 (C-9), 149.5 (C-3), 148.0 (C-4), 145.2 (C-7), 125.6 (C-1), 123.2 (C-6), 115.6 (C-5), 114.3 (C-8), 111.4 (C-2), 55.8 (3-OCH3), 51.3 (9-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[11]，故鉴定化合物5为阿魏酸甲酯。

化合物6：棕色粉末，分子式为C10H9NO2；HR-ESI-MS/: 174.056 2 [M－H]–（C10H8NO2，计算值174.056 1）；1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 12.2 (1H, brs, H-11), 10.93 (1H, s, H-1), 7.55 (1H, d,= 7.9 Hz, H-4), 7.40 (1H, d,= 8.0 Hz, H-7), 7.27 (1H, d,= 2.3 Hz, H-2), 7.12 (1H, m, H-6), 7.03 (1H, m, H-5), 3.70 (2H, s, H-10)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 173.4 (C-11), 136.3 (C-8), 127.4 (C-9), 124.1 (C-2), 121.4 (C-6), 118.7 (C-5), 118.5 (C-4), 111.5 (C-7), 107.8 (C-3), 31.2 (C-10)。以上数据与文献报道基本一致[12]，故鉴定化合物6为吲哚-3-乙酸。

化合物7：淡黄色粉末，分子式为C9H7NO；HR-ESI-MS/: 144.045 6 [M－H]–（C9H6NO，计算值144.045 5）；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 10.07 (1H, s, H-10), 8.93 (1H, brs, H-1), 8.33 (1H, m, H-4), 7.86 (1H, d,= 2.8 Hz, H-2), 7.45 (1H, m, H-7), 7.32～7.34 (2H, m, H-5, 6)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 185.2 (C-10), 136.8 (C-9), 135.3 (C-2), 124.4 (C-5), 123.1 (C-6), 122.0 (C-3), 122.0 (C-4), 119.7 (C-8), 111.5 (C-7)。以上数据与文献报道基本一致[13]，故鉴定化合物7为吲哚-3-甲醛。

化合物8：白色粉末，分子式为C7H7NO；HR-ESI-MS/: 122.060 4 [M＋H]+（C7H8NO，计算值122.060 0）；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.80～7.82 (2H, m, H-2, 6), 7.54 (1H, m, H-4), 7.43～7.47 (2H, m, H-3, 5), 6.12 (1H, brs, H-8a), 5.83 (1H, brs, H-8b)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 169.6 (C-7), 133.4 (C-1), 133.2 (C-4), 128.8 (C-3), 128.8 (C-5), 127.5 (C-2), 127.5 (C-6)。以上数据与文献报道基本一致[14]，故鉴定化合物8为苯甲酰胺。

化合物9：白色粉末，分子式为C15H19NO3；UV（MeOH）maxnm (log ε): 205 (3.656)；ECD （MeOH）max(Δε) 257 (＋0.062), 227 (−0.002), 208 (−0.004), 197 (−0.003) nm；HR-ESI-MS/: 262.143 4 [M＋H]+（C15H20NO3，计算值262.143 7）；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.20～7.30 (5H, m, H-12～16), 5.49 (1H, m, H-3), 4.95 (1H, d,= 8.7 Hz, H-6), 3.38 (2H, dd,= 5.0, 14.5 Hz, H-10), 3.02 (3H, s, N-CH3), 2.07(1H, m, H-7), 0.83 (3H, d,= 6.4 Hz, 9-CH3), 0.44 (3H, d,= 6.8 Hz, 8-CH3)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 170.0 (C-2), 169.3 (C-5), 136.7 (C-11), 128.9 (C-12), 128.9 (C-16), 128.5 (C-13), 128.5 (C-15), 126.8 (C-14), 76.4 (C-6), 57.4 (C-3), 34.8 (C-10), 32.4 (N-CH3), 29.7 (C-7), 18.3 (C-9), 17.5 (C-8)。以上数据与文献报道基本一致[15]，故鉴定化合物9为(3,6)-4-甲基-6-(1-甲基乙基)-3-苯甲基全氢-1,4-噁嗪-2,5-二酮。

化合物10：黄色粉末，分子式为C17H12N2O4；HR-ESI-MS/: 309.086 7 [M＋H]+（C17H13N2O4，计算值309.087 0）；1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 11.61 (1H, s, H-9), 8.84 (1H, s, H-4), 8.42 (1H, d,= 4.0 Hz, H-5), 7.82 (1H, d,= 8.4 Hz, H-8), 7.65 (1H, t,= 7.1 Hz, H-7), 7.43 (1H, d,= 3.2 Hz, H-3′), 7.34 (1H, t,= 7.5 Hz, H-6), 6.63 (1H, d,= 3.6 Hz, H-4′), 5.53 (1H, brs, 6′-OH), 4.69 (2H, s, H-6′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 166.5 (C-10), 157.3 (C-5′), 151.3 (C-2′), 141.4 (C-8a), 137.0 (C-3), 132.5 (C-1a), 132.0 (C-1), 129.9 (C-4a), 129.0 (C-7), 122.1 (C-5), 121.0 (C-5a), 120.6 (C-6), 115.8 (C-4), 112.9 (C-8), 111.3 (C-3′), 109.3 (C-4′), 56.0 (C-6′)。以上数据与文献报道基本一致[16]，故鉴定化合物10为酒渣碱。

化合物11：白色粉末，分子式为C20H30O6；HR-ESI-MS/: 365.196 1 [M－H]–（C20H29O6，计算值365.197 0）；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 5.96 (1H, s, H-14), 5.81 (1H, dd,= 10.9, 18.0 Hz, H-15), 5.00 (2H, m, H-16), 4.33 (1H, s, H-7), 3.92 (1H, d,= 9.4 Hz, H-20a), 3.83 (1H, m, H-11), 3.32 (1H, d,= 9.4 Hz, H-20b), 1.87 (1H, m, H-12a), 1.85 (1H, m, H-12b), 1.82 (1H, m, H-1a), 1.77 (1H, m, H-3a), 1.70 (1H, m, H-1b), 1.68 (1H, m, H-2a), 1.60 (1H, m, H-2b), 1.40 (3H, s, 19-CH3), 1.22 (3H, s, 18-CH3), 1.18 (1H, m, H-3b), 1.12 (3H, s, 17-CH3)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 146.5 (C-15), 136.8 (C-8), 133.3 (C-14), 111.6 (C-16), 106.1 (C-6), 81.4 (C-5), 77.2 (C-9), 73.4 (C-7), 68.5 (C-20), 67.4 (C-11), 50.2 (C-10), 40.5 (C-12), 38.5 (C-13), 38.1 (C-4), 37.9 (C-3), 27.8 (C-18), 25.4 (C-17), 24.9 (C-1), 24.4 (C-19), 18.2 (C-2)。以上数据与文献报道基本一致[17]，故鉴定化合物11为腐皮壳素A。

4 讨论

本研究从新鲜附子中分离得到一株内生真菌，通过18 S测序比对鉴定为木霉菌sp.。采取一系列化学手段对其固体发酵产物进行提取分离纯化，共鉴定出11个化合物，其中化合物1～3为异香豆素，3者的区别在于官能团的不同；化合物4、5均为酯类化合物；化合物6、7为简单吲哚生物碱，是由吲哚母核的3位分别连接乙酸基和甲醛基而成；化合物8为简单酰胺类生物碱；化合物10为简单-b-卡波林碱类生物碱；化合物11为二萜类化合物。除化合物5、7外，其余化合物均为首次从木霉菌中分离得到。经查阅文献发现，化合物2和3均有较强的抗真菌及乙酰胆碱酯酶抑制活性[5-6]；化合物6对细菌生长具有抑制作用[18]；化合物8能有效抑制乙酰胆碱酯酶活性[19]；化合物9能有效诱导人白血病细胞凋亡[12]；化合物10能够显著抑制HIV-1的活性[16]；化合物11对金黄色葡萄球菌和石膏样小孢子菌均显示出抗菌活性[17]。本研究不仅丰富了木霉菌次生代谢产物的种类，为木霉菌的活性物质研究提供了一定的参考，也为开发附子内生菌的次生代谢产物提供了一定的研究基础。据报道，本研究所得化合物大部分具有较好的药理活性，表明附子内生菌的次生代谢产物具有一定药用潜力，因此可将内生菌作为进一步开发附子药用潜力的切入点。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Chemical constituents of endophytic fungisp. FZ-31 from

CHEN Xiao-jing, ZHU Li-jun, DUAN Li-xin, LIU Zhong-qiu, CUI Hui, ZHAO Zhong-xiang

School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 511400, China

To study the chemical constituents of endophytic fungisp. FZ-31 from.The fermentation ofsp. FZ-31 was isolated and purified through silica gel, Sephadex LH-20 as well as preparative HPLC, and the structures of obtained compounds were identified by NMR, MS, and circular dichroism.Eleven compounds were isolated and identified as (–)-mellein (1), ()-7-hydroxymellein (2), 4-hydroxymellein (3), gibepyrone D (4), methyl ferulate (5), indole-3-acetic acid (6), indol-3-carbaldehyde (7), benzamide (8), (3,6)-4-methyl-6-(1-methylethyl)-3- phenylmethylperhydro-1,4-oxazine-2,5-dione (9), flazine (10), and diaporthein A (11).Except compounds 5 and 7, the remain compounds are isolated fromsp. for the first time. This study provides a certain study basis forand its endophytic fungi.

Debx.; endophytic fungus;sp.; secondary metabolites; (–)-mellein; gibepyrone D; flazine; diaporthein A

R284.1

A

0253 - 2670(2021)04 - 0931 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.04.004

2020-11-02

国家重点研发计划（2017YFE0119900）；国家自然科学基金面上项目（81874343）

陈小晶，女，硕士研究生，研究方向为天然药物化学。E-mail: 1960243389@qq.cpm

崔 辉，男，博士，研究员，研究方向为天然药物化学。E-mail: cuihui@gzucm.edu.cn

赵钟祥，男，博士，教授，研究方向为天然药物化学。E-mail:zzx37@163.com

[责任编辑 王文倩]