基于蛋白质组学分析羊乳、牛乳和人乳的蛋白质功能特性

任 荣，杨博睿，彭海帅，王毕妮*，张富新，惠媛媛，贾 蓉

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710062）

乳类物质是一种营养丰富的理想食品，富含人体生长发育的必需氨基酸、短中链脂肪酸以及钾、磷、钙和其他矿物质[1]。人类食用乳及乳制品的历史悠久，早在古代李时珍所著的《本草纲目》就指出：奶汁主治补五脏，令人肥白悦泽、益气、治瘦悴、悦皮肤、润毛发[2]。乳中营养成分的含量和种类受遗传、生理及环境条件等影响，其中产乳动物的品种多样化一定程度影响乳中蛋白质合成水平、肽链的磷酸化和糖基化及氨基酸序列[3]。目前，市场上的乳及乳制品主要以牛乳和羊乳为原料，其他小众乳在特定区域同样具有重要的营养和经济价值，例如驼乳、马乳、驴乳、鹿乳等，其口味和营养成分也因种类、饲料、环境和挤乳环境等有很大差异[4]。

奶牛养殖规模大、产量高、品种丰富，牛乳已成为越来越多消费者生活中必不可缺的饮食选择。近年来，随着羊乳的营养价值逐渐被更多的消费者所认知，羊乳市场不断扩大，世界羊乳消费量总体上持续增长[5]。牛乳中蛋白质种类较多，酪蛋白和叶酸含量均较高；而羊乳中脂肪球较小，含有更多的不饱和脂肪酸、矿物质和维生素等营养因子[6]。牛乳和羊乳作为乳品行业开发和研究的主要乳源，研究者们在研发婴幼儿乳粉时也一直致力于调整其营养成分，使其更接近于人乳，从而确保婴儿的肠道消化和营养吸收。蛋白质作为乳中的关键成分，具有多种分子功能。例如，酪蛋白胶束提供对能量、组织生长和细胞功能至关重要的必需氨基酸。此外，一些蛋白质可以作为激素或抗菌物质等[7]。因此研究不同品种乳中蛋白质表达的差异，可以在分子层面上深入了解相应的营养特性，获得特定的蛋白质生物标志物，为消费者健康饮食提供指导。

蛋白质组学是解析蛋白质成分的主要技术手段。自20世纪90年代将蛋白质组学应用于牛乳研究，鉴定了6 种主要蛋白质及其遗传变异体外，取得了重大进展。目前国内外的蛋白质组学技术已经十分成熟，能够检测、识别和量化蛋白质，如生物活性肽[8]、乳清蛋白[9]及乳脂肪球膜蛋白[10]。关于蛋白质组学的基础应用以及在哺乳期、乳品加工和贮藏期间蛋白质的变化，已经有许多相关研究报道[11-13]。本研究通过研究羊乳、牛乳和人乳的基本成分，并通过超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技术对3 种乳中所含有的蛋白质进行分析，通过基因本体论（gene ontology，GO）注释、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库及蛋白质相互作用网络分析不同品种乳中的蛋白质富集程度及所发挥的分子功能，探究可能影响其品质的潜在关键蛋白，为后续蛋白质调控研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羊乳取自饲养于西北农林科技大学实验农场的30 只Saanen山羊；牛乳采自西安银桥乳业公司饲养的30 只黑白花乳牛；人乳由西安市3 名处于哺乳期的女性志愿者提供。采样时充分混合，-80 ℃贮藏。

尿素、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘代乙酰胺 美国Sigma公司；甲酸、乙腈、四乙基溴化铵（tetraethyl-ammonium bromide，TEAB） 美国Fisher Chemical试剂公司；蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶 美国Promega试剂公司；BCA试剂盒 上海碧云天生物技术公司。

1.2 仪器与设备

ZORBAX 300 Extend C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）美 国A g i l e n t公 司；F D U-1 2 0 0真 空 冷 冻干燥机 上海爱朗仪器有限公司；UPLC系统（EASYnLC 1000）、Q ExactiveTMPlus组合型四极杆-OrbitrapTM质谱仪 美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 乳成分分析

样品室温解冻后，利用乳成分分析仪测定羊乳、牛乳和人乳中的蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质、干物质含量，重复测定3 次。

1.3.2 蛋白溶液制备

上述解冻后的乳样3 500 r/min离心10 min，去除上层脂肪，余下清液和蛋白质沉淀混合均匀。准确吸取100 μL，加入400 μL裂解缓冲液（含8 mol/L尿素、1 g/100 mL蛋白酶抑制剂），在细胞破碎仪中400 W超声裂解20 s，12 000×g低温离心10 min，收集上清液转移至新的洁净离心管，按照BCA试剂盒说明书步骤测定各样品总蛋白质含量。

1.3.3 蛋白质酶解消化

取50 μL 1.3.2节所得上清液，加入等体积25 mmol/L NH4HCO3溶液（含10 mmol/L DTT），56 ℃水浴30 min进行蛋白质还原反应；反应完成后将混合液取出冷却至室温，迅速加入等体积0.1 mol/L烷基化试剂（25 mmol/L NH4HCO3溶液，含55 mmol/L碘代乙酰胺），室温下暗反应30 min；最后通过添加0.1 mol/L TEAB缓冲溶液将每个样品溶液尿素浓度稀释至2 mol/L，以胰蛋白酶与蛋白质质量比1∶100添加胰蛋白酶，37 ℃酶解消化3 h，再以质量比1∶50加入胰蛋白酶，2 次消化过夜。消化完成后向混合体系中添加50 μL体积分数1%甲酸溶液终止酶解反应，4 ℃、12 000×g离心10 min，得到酶切肽段上清液[14]。

1.3.4 肽段纯化

肽段上清液用反相UPLC分级，色谱柱为Agilent 300 Extend C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。肽段分级流动相梯度设置为8%～32%乙腈、pH 9.0，1 h内分离出60 个组分，合并为4 组，再经真空冷冻干燥后保存在-80 ℃冰箱内，待测[15]。

1.3.5 UPLC-MS/MS分析

肽段使用EASY-nLC 1000 UPLC系统进行分离，电离后在Q ExactiveTMPlus质谱仪中进行分析。分析条件参考周玉成等[16]的方法，其中扫描条件作出一定调整：一级质谱扫描范围m/z350～1 800，扫描分辨率70 000；二级质谱扫描范围m/z200，扫描分辨率17 500。

1.3.6 NCBI数据库搜索

使用Maxquant搜索引擎（http://www.maxquant.org/）检索NCBICapra hircus数据库，胰蛋白酶被指定为裂解酶，缺失裂解数目设置为2。一级母离子的质量容限设置为20 Da，二级碎片离子的质量容限设置为0.02 Da。半胱氨酸上的烷基化设为固定修饰，甲硫氨酸的氧化、蛋白N端的乙酰化、天冬酰胺和谷氨酰胺的脱酰胺化均设为可变修饰。错误发现率（false discovery rate，FDR）均调整为＜1%，肽段的最低分数设置为＞40。

1.3.7 生物信息学分析

GO注释蛋白质组来源于UniProt-GOA数据库（http://www.ebi.ac.uk/GOA/）。InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）将用作某些未注释蛋白质的替代软件。通过GO注释将蛋白质分为3 类：生物过程、细胞成分和分子功能。KEGG数据库用于蛋白质通路的注释和富集分析。以数据库中的所有蛋白质为对照，检验鉴定出的蛋白质的富集程度，根据KEGG网站通路层级分类方法将通路进行分类。在STRING数据库（https://version-10-5.string-db.org/）搜索对比所有已识别的蛋白质数据库编号或序列，按照Confidence Score＞0.7（high confidence）提取得到鉴定蛋白的相互作用关系。然后，使用R包的networkD3工具（https://cran.r-project.org/web/packages/networkD3/）进行蛋白质相互作用网络的识别可视化。对于每个类别，均采用双尾Fisher精确检验，富集检验P＜0.05则认为差异显著。

1.4 数据处理

结果均以平均值±标准差的形式表示。使用IBM SPSS Statistics 22软件进行统计分析，测试方法设置为单因素方差分析，Duncan’s test作多重比较，采用双尾Fisher精确检验，P＜0.05定义为差异显著。

2 结果与分析

2.1 羊乳、牛乳和人乳的基本成分分析

表 1 羊乳、牛乳和人乳的基本成分Table 1 Basic components of goat milk, cow milk, and human milk%

由表1可知，3 种乳样在基本成分含量上有较大差别，羊乳和牛乳的蛋白质含量和矿物质含量均显著高于人乳（P＜0.05）。人乳的蛋白质含量虽然较少，但是其分子质量较高，必需氨基酸种类丰富，还含有丰富的生物活性成分，如表皮生长因子、胰岛素样生长因子1、环核苷酸及乳铁蛋白等，能够满足人体生长所需；羊乳和人乳的脂肪含量较高，显著高于牛乳（P＜0.05），其中人乳中的不饱和脂肪酸含量较高，能促进婴幼儿的智力发育[17]；乳糖是乳中含量最高的营养成分，人乳中乳糖含量最高，大约为6.92%（P＜0.05）。虽然3 种乳蛋白质、脂肪、乳糖和矿物质含量有一定差异，但干物质含量基本维持在12.00%以上，并且无显著差异。研究发现，乳中的αs1-酪蛋白和β-乳球蛋白是引起蛋白质过敏反应的2 种蛋白，与牛乳相比，羊乳中含有较低含量的αs1-酪蛋白和β-乳球蛋白，而这2 种过敏原在人乳中含量极低，这也是羊乳有利于缓解人体乳糖不耐受症的主要原因[18-19]。

2.2 羊乳、牛乳和人乳中蛋白质的鉴定

图 1 羊乳、牛乳和人乳中鉴定出的蛋白种类韦恩图Fig. 1 Venn diagram of unique and shared proteins among goat milk,cow milk, and human milk

本研究通过UPLC-MS/MS技术，对3 种乳样进行非标记性蛋白质组研究，并且对所有鉴定到的蛋白质进行蛋白注释、功能分类和功能富集分析。由图1可知，在羊乳、牛乳和人乳中共鉴定出3 370 种蛋白质，包括1 023 种羊乳蛋白、789 种牛乳蛋白和1 558 种人乳蛋白。其中，共307 种蛋白质在3 种乳间共有。人乳中的蛋白质种类明显高于羊乳和牛乳，这可能是酪蛋白含量不同造成的，牛乳中酪蛋白含量高于羊乳和人乳，影响了某些低分子质量蛋白的表达[20]。

2.3 乳蛋白的GO注释

GO是表达基因及其产物特性的重要生物信息学分析方法和工具，解释了蛋白质在不同方面的生物学效应。分别对3 种乳样中蛋白质的GO注释情况进行统计。

图 2 羊乳（A）、牛乳（B）和人乳（C）蛋白质的GO二级分类统计图Fig. 2 GO secondary classification statistics of proteins in goat milk (A),cow milk (B), and human milk (C)

由图2可知，与乳蛋白有关的生物过程主要集中在细胞过程、代谢过程、单组织过程、生理调节、应激反应、定位及信号传导，这些生物学过程与细胞的生长和生物学应激有关。多细胞组织过程、细胞成分组织及合成、发育过程、免疫系统过程和多组织过程在牛乳和人乳中特有，而羊乳蛋白参与较少。在细胞成分分类中，牛乳蛋白主要作用于细胞和细胞器，而牛乳和人乳中的部分蛋白质在腔上包膜和细胞连接处表达水平较高。所鉴定出蛋白的分子功能主要涉及结合功能和催化活性，其余大部分与分子结构和信号转导有关。与羊乳蛋白相比较，部分牛乳和人乳蛋白质的分子功能富集在分子转导活性方面。羊乳、牛乳和人乳在GO分析的3 个类别上均有些许蛋白富集差异，但在生物学过程、作用位置及主要功能分布上整体一致。

2.4 KEGG通路富集分析

机体内生理功能的发挥并不是某个或某几个蛋白质发挥作用而产生的，而是通过相互作用于某一模块或路径。KEGG是连接已知分子间相互作用的信息网络，如代谢通路、复合物、生化反应。因此通过KEGG通路富集分析羊乳蛋白、牛乳蛋白及人乳蛋白的主要作用途径。

图 3 羊乳（A）、牛乳（B）和人乳（C）的KEGG通路富集柱状图Fig. 3 KEGG pathway enrichment in goat milk (A), cow milk (B), and human milk (C)

选取富集程度（-lgPval）前10的代谢通路分别作柱状图横向比较，由图3可知，羊乳蛋白中富集程度较高的代谢通路为核糖体通路（chx03010）、碳代谢通路（chx01200）和蛋白质在内质网的加工通路（chx04141），牛乳蛋白中富集程度较高的代谢通路为溶酶体通路（bta04142）、吞噬体通路（bta04145）和内吞作用通路（bta04144），人乳蛋白中富集程度较高的代谢通路为核糖体通路（hsa03010）、蛋白酶体通路（hsa03050）及蛋白质在内质网的加工通路（hsa04141）。

在羊乳、牛乳和人乳3 种乳样中，编号04141的蛋白质在内质网的加工通路均有较高富集程度，分别有49 种羊乳蛋白、29 种牛乳蛋白及58 种人乳蛋白参与此过程。内质网对蛋白质的加工过程主要包括糖基化、羟基化、酰基化及二硫键形成等，其中最主要的是糖基化过程，几乎所有内质网上合成的蛋白质最终均被糖基化，使蛋白质能够抵抗消化酶的作用，赋予蛋白质信号传导的功能。因此参与该通路的蛋白质种类差异会导致蛋白质合成过程及其生理功能的改变，从而影响不同品种乳样中最终蛋白质含量及生物效能。

2.5 羊乳、牛乳和人乳共有蛋白质相互作用分析

在生物体中，蛋白质并非孤立存在，其功能的行使必须借助于其他蛋白质的调节和介导，这种调节或介导作用的实现首先要求蛋白质之间有结合作用或相互作用。蛋白质相互作用网络对于揭示蛋白质功能具有重要意义。例如，高度聚集的蛋白质可能具有相同或相似的功能；连接度高的蛋白质可能是影响整个系统代谢或信号转导途径的关键点。

图 4 羊乳、牛乳和人乳共有蛋白的蛋白质相互作用网络图Fig. 4 Protein-protein interaction network of goat milk, cow milk,and human milk

通过STRING数据库对羊乳、牛乳和人乳种共有的307 种蛋白质进行相互作用分析，由图4可知，其中的关键蛋白质分别为丙糖磷酸异构酶1、磷酸甘油酸变位酶1、丙酮酸激酶M、磷酸甘油酸酯激酶1、果糖二磷酸醛缩酶A等，参与的关键通路主要为碳代谢、糖酵解/糖异生、氨基酸生物合成、白细胞跨内膜迁移等。其中磷酸甘油酸变位酶1作为糖酵解通路的重要酶之一，催化糖酵解通路中3-磷酸甘油酸转化生成2-磷酸甘油酸，促进葡萄糖代谢和能量生成，可作为肿瘤代谢调控的新靶标，其抑制剂的研发受到越来越多的关注[21]。与热休克蛋白8相互作用的蛋白质约有7 个，参与不同的代谢通路，热休克蛋白8是热休克蛋白70家族的一员，可与新生多肽结合，以促进正确折叠，热休克蛋白8在膜蛋白包被的小泡通过细胞膜成分的转运中起着ATP的作用[22]。因此该蛋白可作为潜在重要标志物继续进一步分析其上调或下调后对机体的影响。

3 结 论

对羊乳、牛乳和人乳3 种乳样进行基本成分测定，并通过非靶标UPLC-MS/MS技术对3 种乳所含蛋白质进行生物信息学定性分析。结果表明：3 种乳样的基本成分含量有较大差别，羊乳和牛乳的蛋白质含量和矿物质含量较高，羊乳和人乳的脂肪含量较高，人乳的乳糖含量最高，干物质含量无明显差异；蛋白质酶解消化后共鉴定出3 370 种蛋白质，GO注释分析表明，与乳蛋白有关的生物过程主要集中在细胞和代谢过程，细胞定位在腔体和细胞器上，分子功能表现为结合功能和催化活性；KEGG通路在3 种乳中富集程度和种类有差异，共有的高富集通路为蛋白质在内质网的加工过程；蛋白质相互作用中的共有蛋白质主要集中在碳代谢、糖酵解/糖异生、氨基酸生物合成等通路，对这些蛋白质的功能和作用机制进行深入研究，可以为羊乳、牛乳和人乳互补、提高机体营养吸收和利用提供科学依据，并且为促进乳品蛋白质相互作用机制的研究提供参考。