母乳低聚糖组成及其对益生菌的增殖作用

揭 良，苏米亚，贾宏信，陈文亮，齐晓彦

（乳业生物技术国家重点实验室，上海乳业生物工程技术研究中心，光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海 200436）

母乳低聚糖（human milk oligosaccharides，HMOs）是结构多样的非共轭低聚糖，其结构复杂，种类较多，HMOs结构由5 种基本单糖单体组成，单糖单体分别为D-葡萄糖、D-半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、L-岩藻糖和唾液酸，聚合方式为在乳糖基础上以β-1,3或β-1,6键连接半乳糖β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖双糖（双糖称为lacto-N-biose），形成HMOs的核心结构，在乳糖或核心结构基础上可以再延伸，进行岩藻糖化或唾液酸化[1]。母乳中的低聚糖含量远高于牛乳，其中被报道的HMOs超过200 种，但研究报道较多的是20多种常见HMOs[2-3]。国外研究报道成熟期母乳中HMOs含量为5～15 g/L，是母乳中第三大固体成分[4-5]。HMOs按结构不同主要分为中性岩藻糖基化、中性非岩藻糖基化和酸性唾液酸化HMOs三大类，其中中性HMOs占比最大，2’-岩藻糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）、乳酰-N-岩藻五糖Ⅱ（lacto-N-fucopentaose Ⅱ，LNFPⅡ）和乳糖-N-四糖（lacto-Ntetraose，LNT）是含量较为丰富的中性HMOs[6-8]。

母乳是婴儿出生后最初6 个月的唯一食物，若母乳喂养不能实现时，婴儿配方乳粉作为替代品也是低聚糖的一个可能来源。低聚糖产品，如低聚半乳糖（galactooligosaccharides，GOS）和低聚果糖（fructo oligosaccharide，FOS）已被引入婴儿配方乳粉中，然而它们与HMOs结构不同[4]。相比婴幼儿配方乳粉喂养，母乳喂养婴幼儿的消化不良、便秘、过敏和炎症等问题得到显著改善[9]。研究发现，母乳相比于配方乳粉含有较高含量的HMOs。这些HMOs不被消化，可直接到达肠道并被肠道内有益菌（双歧杆菌和乳杆菌）选择性利用，进而改善肠道健康[10]。大量文献报道了HMOs能够改善婴幼儿的肠道环境，促进益生菌增殖，抑制致病菌的生长，减少婴幼儿便秘和胃肠炎的发生，减轻婴幼儿的过敏症状等[11-13]。而且研究报道HMOs添加到婴儿配方乳粉中是安全的，且耐受性良好，含有HMOs婴儿配方乳粉的功效更接近母乳[14]。因此对HMOs组分进行深入研究，对于优化和改进婴幼儿配方乳粉，更好模拟母乳功能具有重要意义。国内HMOs研究相对落后，对母乳内复杂的HMOs进行全面分析的研究还较少，现有研究还无法为我国母乳研究提供较确切且全面的HMOs数据。本研究主要分析HMOs含量和种类，并探究单类HMOs对益生菌的影响，为HMOs研究及开发适合我国婴幼儿营养特点的配方乳粉产品提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

收集中国健康、营养良好的足月儿母亲成熟乳20 份，同时签署知情同意书。随机取10 份混合，共得到2 个混合样（混合样1、2）。

MRS培养基 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；不含碳水化合物来源的半自制MRS培养基（含1%细菌蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.2%磷酸钾、0.5%乙酸钠、0.2%柠檬酸钠、0.02%硫酸镁、0.005%硫酸锰、0.1%吐温-80、0.003%溴甲酚红紫）、双歧杆菌Bb-12、发酵乳杆菌CECT5716 杜邦中国集团有限公司；HMOs标品（色谱纯） 英国Carbosynth公司；2’-FL（色谱纯） 美国Sigma公司；FOS和GOS（FOS、GOS比例1∶9）（分析纯） 保龄宝生物股份有限公司。

1.2 仪器与设备

A35厌氧培养箱 英国Don Whitley Scientific公司；ICS-5000离子色谱仪 美国Thermo Fisher公司；TE612-L电子天平 德国Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 母乳中HMOs组成和含量测定

取1 mL母乳与1 mL无水乙醇混合均匀并密封，于4 ℃冰箱放置60 min，取出于4 ℃冷冻离心机10 000 r/min离心20 min；取所有上清液，氮吹除去乙醇，再用甲醇溶液定容至50 mL容量瓶，样液经0.22 μm亲水膜过滤后进样，采用离子色谱仪进行HMOs组分检测，并以HMOs标准品作对照，外标法定量分析母乳样品HMOs组分含量[15]。

1.3.2 HMOs对益生菌增殖的影响

为研究H M O s对双歧杆菌B b-1 2和发酵乳杆菌CECT5716生长的影响，将2 种菌株分别接种于MRS培养基，37 ℃孵育36 h后分别取100 μL至不含碳水化合物来源的半自制MRS培养基。添加碳水化合物（4 个组别：2 g/100 mL 2’-FL、1 g/100 mL 2’-FL＋1 g/100 mL FOS和GOS、2 g/100 mL FOS和GOS、空白对照）。每种菌株在添加不同碳水化合物的半合成培养基（10 mL）中培养，每组3 个平行样，37 ℃厌氧培养48 h。采用分光光度计每隔8 h在600 nm波长处测定光密度（optical density，OD），记录OD600nm[16-17]。

1.4 数据处理

采用Origin 9.0软件进行数据统计、处理和绘图。

2 结果与分析

2.1 我国母乳HMOs组成特点

由表1可知，2 个混合样本的母乳HMOs含量分别为10.613、5.093 g/L，与文献报道的母乳HMOs含量一般为5～15 g/L[18]相一致。2 个混合样本总HMOs含量差异很大，说明HMOs在不同个体母乳中的含量存在很大差异。母乳HMOs种类和含量主要受乳母的先天性差异、孕龄及哺乳期的影响[19-21]。研究表明，母乳中HMOs的先天差异可以通过乳母的分泌状态来解释，如1,2-岩藻基HMOs在分泌型母乳中大量存在，而在非分泌型母乳中则基本不存在[19]。1,3/1,4-岩藻基HMOs含量在非分泌型母乳中较高，而在分泌型母乳中较低[20]。正常情况下，分泌型和非分泌型母乳中HMOs的差异主要为分泌型母乳中中性HMOs含量较高。从单个种类的HMOs可以看出，受个体母乳影响的HMOs种类主要有2’-FL、3’-FL、LNFPⅠ、LNDFHⅠ和6’-SL。2 个混合母乳样本中中性HMOs含量远高于唾液酸化HMOs，中性HMOs分别占2 个混合母乳样本总HMOs含量的74.1%和90.3%。大量文献报道2’-FL是分泌型母乳中最主要的HMOs，2’-FL和LNFPⅠ在分泌型母乳中大量存在[21-24]。本研究2 个混合母乳样本中，混合样2中最主要的HMOs有2’-FL、3’-FL、LNT、LNFPⅡ等，2 个混合样中含量最多的都是3’-FL，说明收集的母乳中有一部分是非分泌型母乳。

表 1 足月儿母亲成熟乳HMOs组成（n＝10）Table 1 HMOs composition of mature breast milk of mothers of term newborns (n= 10)g/L

2.2 不同国家母乳HMOs对比

HMOs主要分为中性岩藻糖基化、中性非岩藻糖基化和酸性唾液酸化HMOs。将本研究的国内母乳和不同国家报道的母乳中上述3 类主要HMOs占比进行分析和对比[24-27]。不同国家母乳HMOs总含量不同，受较多因素，如哺乳期、胎龄、分泌状态和产妇状况等影响，但3 类HMOs含量占比较相似。

母乳中HMOs占比最高的种类为中性岩藻糖基化HMOs，平均占比均为60%以上，远远高于唾液酸化HMOs和中性非岩藻糖基化HMOs。而不同国家母乳中唾液酸化HMOs和中性非岩藻糖基化HMOs在母乳总HMOs中占比相差较大。本研究母乳中唾液酸基化HMOs占比高于中性非岩藻糖基化HMOs，这和其他国家有差异。这种差异的发生除了样品收集方法和分析方法可能导致的差异外，还有可能与不同地区和国家膳食差异有关。

2.3 HMOs对双歧杆菌Bb-12和发酵乳杆菌CECT5716的增殖作用

HMOs对婴儿的健康有较多有益影响，如改善肠道微生物健康、大脑发育、免疫系统、呼吸系统和包括肾脏和肝脏在内的器官功能[28-29]。婴儿肠道的微生物组成和多样性从出生开始持续到出生后的前2～3 年，对婴幼儿的生长和发育极为重要[27]。HMOs对改善婴幼儿肠道微生物菌群分布具有重要作用[30-31]。本研究采用2 种常见的益生菌（双歧杆菌Bb-12和发酵乳杆菌CECT5716）验证单种HMOs对益生菌的增殖效果。

图 1 HMOs对双歧杆菌Bb-12的增殖效果Fig. 1 Effect of HMOs on the proliferation of Bifidobacterium bifidum Bb-12

由图1可知，相比空白组，添加2’-FL组的双歧杆菌Bb-12明显得到一定的增殖，说明双歧杆菌Bb-12可以利用HMOs来生长。但与FOS和GOS组相比，HMOs组对双歧杆菌Bb-12的增殖效果明显较弱，这可能和FOS和GOS中含有一定含量的单糖或双糖有关。FOS和FOS对益生菌的增殖效果很可能是由于其中所含的葡萄糖。HMOs目前和潜在的应用主要集中在婴儿营养方面，2’-FL对双歧杆菌Bb-12的增殖作用说明HMOs的有益健康价值不局限于婴儿。研究表明，2’-FL和LNnT大在龄儿童和成人中具有相似的安全性和耐受性，能显著改善他们的肠道菌群结构[32]。HMOs对一些益生菌的增殖效果并不是直接利用HMOs产生的，而是由其他微生物代谢HMOs产生的低聚糖代谢物间接影响益生菌生长和增殖[33]。正是这些不同微生物和HMOs之间的直接或间接相互作用促进人体的肠道健康。

图 2 HMOs对发酵乳杆菌CECT5716的增殖效果Fig. 2 Effect of HMOs on the proliferation of Lactobacillus fermentum CECT5716

由图2可知，相比空白组，添加2’-FL组的发酵乳杆菌CECT5716同样也明显得到一定的增殖，说明2’-FL能被发酵乳杆菌CECT5716利用。发酵乳杆菌CECT5716于2016年新列入《可用于婴儿食品的菌种名单》，是分离自健康母乳的有益菌种，可用于婴幼儿配方乳粉。HMOs对发酵乳杆菌CECT5716增殖的作用说明婴幼儿配方乳粉中若同时添加HMOs和发酵乳杆菌CECT5716，可实现改善肠道健康的协同作用。同样，FOS和GOS的增殖效果可能是含有一定量葡萄糖的原因。大量研究表明，含FOS或GOS的婴儿配方乳粉能促进婴儿肠道乳酸杆菌和双歧杆菌的增殖[34-36]。因此可通过添加GOS和FOS等成分来模拟HMOs，但它们不是HMOs，并不能完全替代HMOs的功能。

3 结 论

HMOs的研究是当今母乳和新生儿营养领域研究的一大热点。过去的几十年，母乳成分和婴儿营养需求方面的研究取得了很大发展。补充HMOs对不能母乳喂养的新生儿是一个有吸引力的选择。本研究对HMOs组成进行检测和分析，为避免单个母乳样本差异性带来的影响，将不同乳母的母乳样本进行混合。2 个混合样本的HMOs含量分别为10.613、5.093 g/L，差异依然很大，说明不同乳母来源的母乳HMOs差异受诸多因素影响，但含量一般为5～15 g/L。同时研究母乳中主要的HMOs之一2’-FL对常见益生菌的增殖效果。结果表明，2’-FL对发酵乳杆菌CECT5716和双歧杆菌Bb-12都有一定的增殖效果，说明一些益生菌可以利用HMOs进行生长和增殖，尽管FOS和GOS也有一定增殖效果，且已经应用在婴幼儿配方乳粉中，但它们不是HMOs，并不能完全替代HMOs的功能。未来的研究应该建立样本量较大的我国HMOs大数据库，并充分分析各种因素对HMOs的影响，为实现母婴的个体化营养提供参考。同时随着分析分离技术和合成水平的提升，研究母乳中不同单种HMOs的功能特点，如2’-FL、3’-FL、LNFPⅠ、LNDFHⅠ和6’-SL等对各种肠道菌的影响。尽管在过去几年研究获得较大突破，特别是对于HMOs的安全性和功能，但实现各种HMOs在食品中的应用仍有许多关键问题需要解决，如HMOs的选择和组合依据、每日所需量等。我国母乳研究领域HMOs数据有限，有必要提供新的和全面的数据，更深刻地认识中国母乳的特点及其对婴幼儿健康的影响。