近平滑假丝酵母ATCC 7330羰基还原酶CpCR的表达及酶学性质研究

宋婷,王帅静,汪沉,吕育财,罗华军,郭金玲,龚大春*

1(中国轻工业功能酵母重点实验室(三峡大学),湖北 宜昌,443002)2(三峡大学 生物与制药学院,湖北 宜昌,443002)

近年来,近平滑假丝酵母Candidaparapsilosis及其来源的羰基还原酶CpCR因广泛的底物谱和优良的催化特性,在香精、功能食品和药物的研发中得到广泛应用[1]。常用于生物催化的近平滑假丝酵母有IFO 0708[2]、CDC317[3]、CCTCC M203011[4-5]和ATCC 7330[6]等优势菌株,均具有自己的底物谱,其中ATCC 7330的底物适应性最强,不仅对4-氯-3-酮基-丁酸乙酯(4-chlor-3-keto-butyrate-ethyl ester，COBE)具有优良的还原能力[7],而且对苯基取代的二酮、酮醛、烯酮及烯胺的立体选择性也非常强[8-9],对芳基烯醇、烯醇酯及吡咯环、噻吩环取代的烯醇酯[10]也具有优良的动力学拆分能力。

羰基还原酶和醇脱氢酶一样,属于氧化还原酶类,广泛存在于细菌、真菌、酵母和动植物体内[11-15],以辅酶NAD(P)+或NAD(P)H作为电子受体和供体,可以特异性地催化酮 (醛) 和醇之间的相互转化,用于合成重要价值的羟基化合物[16-21]。2013年,AGGARWAL等[6]解析了近平滑假丝酵母CandidaparapsilosisATCC 7330的羰基还原酶CpCR的晶体结构,蛋白质数据库为4OAQ,但对该酶的高效表达和酶学性质研究较少[22-24]。

为了系统研究该酶的酶学性质,在本课题组前期研究的基础上[25-27],拟从近平滑假丝酵母C.parapsilosisATCC 7330克隆出一个编码羰基还原酶CpCR的基因(cpcr),并在大肠杆菌中进行高效表达,利用表达载体中的His标签分离纯化重组酶CpCR,并对其酶学性质进行考察。本研究将为近平滑假丝酵母C.parapsilosisATCC 7330羰基还原酶CpCR的分子改造以及催化应用奠定科学基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株CandidaparapsilosisATCC 7330、大肠杆菌EscherichiacoilBL21(DE3)由本实验室鉴定及保存；质粒载体 pACYCDuet-1,上海生工生物工程有限公司；Phusion DNA Polymerase、限制性酶切酶SalI 和PstI,New England Biolabs；T4 连接酶、质粒抽提试剂盒、产物纯化试剂盒,Vazyme 生物技术有限公司；DL 5 000 bp Marker、蛋白质电泳 Marker、6×loading Buffer、5×蛋白上样缓冲液,TAKARA有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG),Calbiochem 公司,纯度>99.9%；Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒,北京康为世纪生物科技有限公司；其他试剂为国产或进口分析纯；PCR 引物合成及测序由上海生工生物技术有限公司完成。

PCR仪(C1000 Touch)、Gel凝胶成像仪(Doc XR+),Bio-Rad公司；紫外可见分光光度计(UV1800),岛津企业管理有限公司；蒸汽灭菌器(SX-700)、落地高速冷冻离心机(MX-307),日本Tomy公司；超微量紫外可见分光光度计(Nano Drop One),Thermo公司；超净工作台(SW-CJ-2FD),苏州净化设备有限公司；恒温培养摇床(ZQLY-180S),上海知楚仪器有限公司；生化培养箱(LRH-250A),泰宏医疗器械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 高效表达载体的构建

以近平滑假丝酵母ATCC 7330全基因组为模板，用引物：pACYC-F：5′-GCCTGCAG(PstI)ATGACTAAAGCAGTACCAGACA-3′；pACYC-R2：5′-TGTCGAC(SalI)TAAGCTTTGAATGCTTTGTCG-3′，扩增CpCR基因。反应体系：0.5 μL基因组 DNA 模板，0.5 μL Phusion DNA polymerase，10 μL Phusion GC Buffer(5×)，2.5 μL pACYC-F(10 μmol/L)，2.5 μL pACYC-R2(10 μmol/L)，1 μL dNTP(10 μmol/L)，1.5 μL DMSO，1.5 μL Mg2+，30 μL ddH2O。扩增条件：98 ℃ 预变性 30 s，98℃ 变性 10 s，53 ℃ 退火20 s，72 ℃ 延伸 45 s，30 个循环，最后 75 ℃ 保温5 min。

CpCR扩增产物经限制性内切酶PstI 和SalI 双酶切后定向克隆至表达载体 pACYCDuet-1，并转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞。转化后，取适量菌液涂布在含 100 μg/mL 氯霉素的 LB 平板上，37 ℃避光培养，筛选阳性转化子。培养提取质粒，经测序验证后，获得克隆载体，命名为pACYCDuet-1-cpcr(如图 1)。

图1 重组表达载体 pACYCDuet-1-cpcr 结构示意图Fig.1 Structural diagram of recombinant expression vector pACYCDuet-1-cpcr

1.2.2 羰基还原酶CpCR目的基因(cpcr)的诱导表达与纯化

挑取含有重组表达质粒的单菌落于含100 μg/mL氯霉素的 LB 培养基中过夜培养。按OD600值为4的比例接种至100 mL诱导培养基(100 μg/mL氯霉素,1 mmol/L Mg2+、1 mmol/L Zn2+)中,23 ℃、200 r/min 条件下培养至OD600为0.6,加入IPTG使终浓度为 0.4 mmol/L,23 ℃诱导16 h。同时与空载体与未诱导大肠杆菌做对照。离心收集菌体,用适当体积的Buffer A (20 mmol/L Tris,500 mmol/L NaCl,5%甘油,0.5 mmol/L PMSF,pH 7.5) 重悬后,超声破碎25 min(工作2 s,停 6 s),4 ℃,12 000 r/mim离心10 min取上清液。分别以上清液、沉淀为蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sufate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测,记录并分析结果。

粗蛋白使用Ni-Agarose柱分离纯化,将具有His标签的目的蛋白上清液经 0.45 μm 滤膜过滤后上柱,分别用 10 倍柱体积Binding Buffer(20 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L 咪唑,500 mmol/L NaCl,pH 8.0)进行洗杂,20 mL Elution Buffer(20 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L 咪唑,500 mmol/L NaCl,pH 8.0)洗脱,并按每 1 mL 流出液分管收集,保存于 4 ℃备用。蛋白样品经 SDS-PAGE检测,记录并分析结果,得到比酶活力高的重组酶CpCR。

1.2.3 蛋白的分析与测定

重组蛋白分析采用SDS-PAGE[18],浓缩胶 5%,分离胶 12%,考马斯亮蓝 R-250 染色显示蛋白条带；蛋白浓度采用 Bradford 法[28]测定。

1.2.4 重组酶CpCR酶活力测定

羰基还原酶的酶活力检测采用分光光度计法。测定方法：总反应体积为 1 mL,包含750 μL 100 mmol/L PB Buffer(pH 7.5),100 μL 40 mmol/L苯甲醛,100 μL 2 mmol/L NADPH,30 ℃ 温育 3 min,最后加入50 μL酶液,用紫外分光光度计在340 nm条件下测定吸光度值的变化。酶活力定义：在30 ℃、pH 7.5条件下,每1 min催化氧化1 μmol NADPH 所需要的酶量定义为1 U。并按公式(1)计算酶活力:

(1)

式中：ΔA为初速度范围内每分钟吸光度值差值,min-1；V总为总反应体积,mL；n为酶液稀释倍数；6.22为NADPH的消光系数,mmol/(L·cm)；d为比色皿直径,1 cm；V为酶液添加体积,mL。

1.2.5 重组酶CpCR的酶学性质研究

1.2.5.1 重组酶CpCR的温度稳定性考察和T50的测定

取适量酶液,采用pH 7.5 的缓冲液按照等体积比进行稀释,置于4～50 ℃ 条件下保温2 h,移取部分酶液,按照1.2.4小节的方法测定剩余酶活力,通过计算相对酶活力,考察该酶温度稳定性,测定该酶的T50值。T50的定义：酶的相对酶活力降低至初始酶活力的50%时所对应的温度。

1.2.5.2 重组酶CpCR的pH 稳定性考察

取适量酶液,分别加入pH 5～8的缓冲液中(pH 5～6采用醋酸-醋酸钠体系、pH 6～7.5采用磷酸-磷酸盐体系、pH 7.5～8采用Tris-HCl体系分别配制100 mmol/L缓冲液),30 ℃保温2 h,按照1.2.4小节的方法测定剩余酶活力,计算相对酶活力,考察该酶的 pH 稳定性。

1.2.5.3 金属离子对CpCR重组酶的影响

在反应体系中加入 1 mmol/L 和 5 mmol/L的8种常见金属离子(K+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+)的氯盐,通过测定相对酶活力研究这些常见金属离子对重组酶CpCR的影响。

1.2.5.4 重组酶CpCR的动力学参数Km、Vmax、Kcat和催化特异性常数Kcat/Km测定

(1)重组酶CpCR对不同底物亲和力和催化特异性常数的考察

分别以苯甲醛、正丁醛、COBE等为底物,选用0.5、1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 mmol/L等不同浓度,参考1.2.4小节的方法选用对应的底物测定吸光度变化值,以 Origin 8.0 对数据进行非线性拟合,按照米氏方程计算并确定该条件下的重组酶的动力学参数Km及Vmax值。依据1.2.3小节的方法测定酶的蛋白含量,结合文献[23]中蛋白质数据库信息和测定的相对分子质量,计算出催化常数Kcat及催化特异常数Kcat/Km。比较重组酶CpCR对上述几种底物的亲和能力和催化效率。

(2)重组酶CpCR对辅酶NADPH和NADH亲和力考察

分别以NADPH和NADH在0.5、1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 mmol/L等不同浓度下,固定苯甲醛浓度为4.0 mmol/L,测定催化反应的吸光度变化值,根据米氏方程确定该条件下的重组酶对2种不同辅助底物的动力学参数Km及Vmax值,比较重组酶 CpCR对辅酶NADPH和NADH的亲和力大小。

2 结果与分析

2.1 羰基还原酶CpCR基因的表达与纯化

2.1.1 目的基因PCR扩增产物的鉴定

以近平滑假丝酵母 ATCC 7330为模板,用引物pACYC-F和pACYC-R2扩增cpcr基因,结果如图2 所示,可见约 1 100 bp 的特异性条带,与预期条带一致,为1 107 bp。

M-DL 5 000 DNA Marker；泳道 1～2为 CpCR 酶基因图2 扩增产物电泳图Fig.2 Electrophoretic map of the PCR amplification products

2.1.2 重组表达载体pACYCDuet-1-cpcr的鉴定

对筛选到的阳性克隆重组表达载体 pACYCDuet-1-cpcr经PstI 和SalI 双酶切,0.8% 琼脂糖凝胶电泳分析,结果如图3所示,可见约 4 kb的载体片段和1.1 kb的目的基因片段。将酶切验证正确的质粒送至上海生工公司测序,结果显示该羰基还原酶基因的序列全长为 1 107 bp,包含 368 个氨基酸的编码序列。

M-DL5 000 DNA Marker；泳道 1-完整重组质粒 pACYCDuet-1-cpcr；泳道 2～5-Pst I 和 Sal I双酶切重组质粒 pACYCDuet-1-cpcr图3 重组表达载体 pACYCDuet-1-cpcr 的酶切电泳图谱Fig.3 Digestion electrophoresis of recombinant expression plasmid pACYCDuet-1-cpcr

2.1.3 CpCR目的蛋白诱导表达及分离纯化

将经测序鉴定正确的表达载体 pACYCDuet-1-cpcr转化至宿主菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达。收集湿菌体,超声破碎后进行SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况。由图4可知,空载质粒菌、未诱导空载质粒菌破碎液均未见目标蛋白；未诱导的重组菌的破碎上清液和沉淀中有目标蛋白,但含量很少；诱导的重组菌的破碎上清液和沉淀中均出现特异性条带,结合NCBI的CpCR酶的蛋白质数据,确定为 41 kDa左右,与预期目的蛋白分子量相近。由此可知,该羰基还原酶在宿主菌E.coliBL21(DE3)中表达成功,但有部分以包涵体形式不可溶表达。

M-蛋白 Marker；1-空载质粒菌；2-未诱导空载质粒菌；3-未诱导重组菌破碎上清液；4-未诱导重组菌破碎沉淀；5-诱导重组菌破碎上清液；6-诱导重组菌破碎沉淀图4 目的蛋白CpCR的SDS-PAGE检测结果Fig.4 SDS-PAGE analysis of the CpCR protein

采用重组菌E.coliBL21(DE3)-pACYCDuet-1-cpcr在 IPTG 诱导下进行异源表达含有 His 标签的羰基还原酶 CpCR,按照1.2.2小节的方法经 Ni-Agarose柱亲和层析纯化后,与重组菌菌体破壁上清液相比(图4),纯化后的目的蛋白条带较单一(图5泳道4)。洗脱液总蛋白含量为 8.3 mg,比酶活力为 20 U/mg,总酶活力为 168 U,总回收率为71%,纯化倍数为 5.5(表1)。本研究比文献[6]报道的利用谷胱甘肽(glutathione,GST)作为标签表达的重组酶CpCR分离纯化耗时少,效率高。

M-蛋白 Marker；1-粗酶液；2-镍柱流穿液；3-镍柱洗涤液；4-洗脱液图5 重组蛋白纯化 SDS-PAGE 电泳Fig.5 Purification of SDS-PAGE electrophoresis by recombinant protein

表1 重组酶 CpCR 的纯化Table 1 Purification of recombinant enzyme CpCR

2.2 重组酶CpCR的酶学性质研究

2.2.1 重组酶CpCR的温度稳定性考察

由图6可知，该酶在 4～35 ℃的温度范围稳定性很好,在33 ℃相对酶活力仍可保持在80% 左右。但是当温度超过35 ℃,相对酶活力迅速降低,37 ℃时,该酶的酶活力降低至初始酶的50%,故该酶的T50值为37 ℃。表明该酶在低温或者室温下保藏较好。

图6 重组羰基还原酶CpCR温度稳定性Fig.6 Temperature stability of recombinantcarbonyl reductase CpCR

2.2.2 重组酶CpCR的pH稳定性考察

由图7可知,重组酶 CpCR在pH 6.2～7.5稳定性较好,相对酶活力保持在80%以上,中性条件下稳定性最好。但该酶在pH低于6和高于8条件下,其相对酶活力降低较快。因此该酶的pH范围相对较窄,在应用过程中要严格控制其催化体系的酸碱性。SUDAKARA等[22]报道来自该菌株的另一种羰基还原酶SRED,采用GST标签表达重组得到,其酶pH稳定性也较窄,其最稳定的pH值为5。重组酶CpCR耐酸碱范围小的特性为该酶的分子改造提供了依据。

图7 重组酶CpCR的pH稳定性Fig.7 pH stability of recombinant carbonyl reductase CpCR

2.2.3 8种常见金属离子对重组酶CpCR的影响

很多羰基还原酶在催化氧化还原反应时需要金属离子的参与,有些金属离子对氧化还原酶具有一定的激活或者抑制作用。由图8 可知,羰基还原酶的酶活力在一定浓度下受金属离子的影响较大。在1 mmol/L低浓度下,除Ca2+和Cu2+外,其他6种的金属离子对重组酶CpCR 的酶活力影响较小；但在加入浓度为 5 mmol/L时,抑制作用明显,重组酶CpCR 相对酶活力降低最大的是Cu2+,几乎降低50%,其次是Ca2+、Fe2+的影响较大,相对酶活力降低到 60% 左右,Ni2+和Mn2+相对酶活力降低到70%左右,而Zn2+的相对酶活力仍然在80%以上。因此Cu2+对CpCR 酶的抑制作用最大,分析其原因可能是由于该羰基还原酶的活性中心含有2个半胱氨酸,分别在48位和167位,Cu2+可能会与酶分子中的半胱氨酸侧链上的巯基基团结合,从而导致酶活力降低。这表明该酶的应用环境要严格控制Cu2+的存在。本研究与SUDAKARA等[21]报道来自该菌株的重组酶SRED的金属离子特性基本一致,在1 mmol/L的Cu2+作用下,SRED相对酶活力下降到初始酶活力的67%。

图8 金属离子对重组酶CpCR的酶活影响Fig.8 Effects of metal ions on the activity of CpCR

2.2.4 重组酶CpCR对不同底物的动力学参数及催化特性参数的考察

由表2可知，重组酶CpCR对2种醛类物质的亲和力均很高,最大反应速度是阿伐他汀药物中间体COBE的7倍。Kcat表示单位时间内每一活性中心或每分子酶所能转换的底物分子数,反映了酶催化特定底物的能力大小。结果显示每个重组酶CpCR分子在1 s可以转化12个分子左右的醛类物质,而对COBE仅能转化近2个分子左右。Kcat/Km是衡量酶的催化效率参数,又称特异性常数,表示不同酶对特定底物的催化效率,或者表示同一种酶对不同底物的催化效率。从表2可以看出,对苯甲醛或正丁醛的催化效率是COBE的20倍左右。文献[23-24]也报道了利用N-端GST标签分离纯化的CpCR酶对苯甲醛、2,4-二氯苯甲醛的米氏常数Km和最大反应速度,和本研究基本一致。重组酶CpCR对苯甲醛、正丁醛亲和力较强,但本研究考察了重组酶CpCR对底物COBE动力学参数和3种底物催化特异性参数,进一步揭示了该重组酶CpCR的催化特性。

表2 重组酶 CpCR 对不同底物 的动力学参数和催化特性参数Fig.2 The dynamics and catalytic parameters of the recombinant enzyme CpCR

2.2.5 重组酶CpCR对两种辅酶NADPH和NADH的亲和力考察

按照1.2.5.4小节的方法,选取不同的NADPH和NADH的浓度开展重组酶初速度测定,根据初速度和辅酶浓度变化曲线,采用Origin 8.0 软件进行非线性拟合,得到NADPH的Km为0.058 mmol/L,而在NADH条件下几乎不反应,说明该重组酶CpCR是NADPH依赖型。与文献[23]报道的GST标签重组CpCR酶依赖辅酶NADPH的结论一致。

3 结论

本实验成功克隆了近平滑假丝酵母CandidaparapsilosisATCC 7330 中的羰基还原酶 CpCR 基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了异源表达。结果表明,该羰基还原酶 CpCR 基因序列全长 1 107 bp,编码 368 个氨基酸,重组酶分子量大小在 41 kDa 左右。重组酶CpCR分离纯化后对底物苯甲醛的比酶活力为 20 U/mg。His标签的重组酶的酶学性质研究表明：重组酶CpCR在33 ℃以下稳定性较好,相对酶活力在80%以上,但随着温度的逐渐升高,酶活力下降较快；该重组酶CpCR的适宜pH范围在6.2～7.5,该酶在酸性和碱性条件下稳定性不好,可以通过蛋白质分子改造进一步提升其适应范围；该重组酶CpCR在K+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+和Mn2+常见金属离子中,在5 mmol/L条件下均有一定抑制,其中Cu2+对该酶的抑制作用最强,相对酶活力下降50%左右；通过该酶对底物的亲和力和催化特性的研究表明,该酶对底物苯甲醛、正丁醛亲和能力强于COBE,对苯甲醛或正丁醛的催化效率是对COBE的20倍左右；该重组酶CpCR是一种NADPH依赖型的羰基还原酶。本研究采用His标签的重组表达的羰基还原酶CpCR与GST标签的重组酶SRED相比在耐酸碱特性上有一定的差异,与GST标签的重组酶CpCR的酶学性质基本相同,但His标签的重组酶分离纯化操作更加方便,效率更高。