“精神益生菌”对慢性应激诱导的抑郁和便秘症状的缓解及机制研究

邹仁英,朱慧越,许梦舒,田培郡,张灏,赵建新,陈卫,王刚

(江南大学 食品学院,江苏 无锡,214122)

抑郁症(depression)是一种常见的精神疾病,临床表现为持续的情绪低落,并伴随有快感缺失、社交孤立、自毁倾向等症状。抑郁症的发病机理十分复杂,现有观点认为其主要与大脑中单胺类神经递质缺乏和下丘脑-垂体-肾上腺轴功能亢进密切相关[1]。近年来大量研究表明,抑郁患者伴随有肠道菌群紊乱的现象,主要体现在乳酸杆菌、双歧杆菌等有益菌的丰度显著降低,而好氧真菌和致病菌的丰度显著上升[2-4]。随着“微生物-肠-脑轴”概念的提出,越来越多的研究将肠道菌群作为防治抑郁症的新靶点[1]。

胃肠消化系统疾病与抑郁症具有极高的共病性,其中便秘是抑郁患者最常见的临床伴随症状之一。MOEZI等[5]针对9 000名成年人的流行病学调查显示,患有抑郁、焦虑等精神疾病的患者出现便秘的概率约为29.8%。研究表明,应激(包括急性应激和慢性应激)是导致排便紊乱的原因之一。应激引发的神经内分泌系统功能异常,不仅能够导致参与消化和蠕动的激素分泌减少,而且能够抑制副交感神经对结肠的支配,进而导致便秘的发生[6]。此外,便秘也是使用精神类药物的副作用之一。研究表明,三环类抗抑郁药物具有明显的抗胆碱作用,可拮抗副交感神经,导致胃肠动力下降,从而引发便秘[7]。由于便秘的高发性,多数抑郁患者会采用泻药协同治疗。长期使用泻药不仅会形成药物依赖,而且会严重损伤肠道屏障功能,甚至导致结肠黑变病[8]。由于目前精神疾病的药物开发相对滞后,能同时缓解抑郁和便秘的新疗法亟待被开发。

益生菌作为一类对宿主有益的活性微生物,可参与调节肠道菌群,进而广泛影响宿主的生理、病理过程。2013年,来自爱尔兰科克大学的神经药理学家JOHN和精神病学家TIMOTHY首次提出了“精神益生菌(psychobiotics)”的概念,不仅将传统益生菌的应用范围推广到了调控神经功能、行为等方面,也为基于“微生物-肠-脑轴”的精神疾病干预策略开辟了具体的实践途径。益生菌对便秘的调节作用已有大量报道,有效种属包括乳杆菌、乳球菌、双歧杆菌、芽孢杆菌等[9-10]。此外,在针对肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)患者的临床试验中,益生菌对患者也展现出良好的情绪和胃肠功能调节作用,例如凝结芽孢杆菌MTCC5856和长双歧杆菌NCC3001[11-12]。这些研究均提示我们,开发具有改善便秘功效的精神益生菌,对于抑郁及胃肠功能异常的预防和治疗具有十分重要的科学和实践意义。此外,目前缺乏益生菌缓解抑郁和便秘的共同机制的研究,而中枢的5-羟色胺(5-hydroxytryptomine,5-HT)和肠道的5-HT分别在调控精神疾病和胃肠道蠕动能力方面起着重要作用,因此5-HT的生物合成及代谢可能直接影响抑郁和便秘。

本研究采用慢性不可预知温和应激构建抑郁和便秘合并的小鼠模型,对复合乳酸菌制剂(包含BifidobacteriumbreveCCFM1025、BifidobacteriuminfantisCCFM687和PediococcusacidilacticiCCFM6432)的抗抑郁、抗便秘效果及益生菌缓解抑郁和便秘的共同机制进行了探究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验菌株

复合乳酸菌制剂由BifidobacteriumbreveCCFM1025、BifidobacteriuminfantisCCFM687和PediococcusacidilacticiCCFM6432按照活菌数1∶1∶1复配而成,上述菌株均来自于江南大学食品学院生物技术中心菌种保藏库。

1.1.2 实验试剂

5-羟色胺(5-hydroxytryptomine,5-HT)、5-羟色氨酸(5-hydroxytryptophan,5-HTP)、色氨酸(L-tryptophan,L-Trp)标准品,美国Sigma公司；乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸标准品,国药集团化学试剂有限公司；小鼠促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)、皮质酮(corticosterone,CORT)ELISA试剂盒,南京森贝伽生物科技有限公司；小鼠炎症因子TNF-α、IL-1β-ELISA试剂盒,美国R&D试剂生产公司；活性炭粉、qRT-PCR相关引物,上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.3 仪器与设备

荧光定量PCR仪,美国Bio-Rad公司；Waters e2695高效液相色谱仪、Waters 2475荧光检测器,美国Waters公司；C18色谱柱(5 μm,150 mm×4.6 mm),日本岛津公司；酶标仪、GC-MS,美国Thermo公司；5415R小型台式离心机,德国Eppendorf公司；GR60DA立式高压蒸汽灭菌器,美国Zealway公司；高通量组织研磨器,宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 灌胃所用菌悬液的制备

实验用菌株(BifidobacteriumbreveCCFM1025、BifidobacteriuminfantisCCFM687、PediococcuslactisCCFM6432)分别于固体培养基上划线分离,挑取单菌落于液体MRS培养基中活化2代,活化后接种于液体培养基中,37 ℃扩培24 h,4 ℃、6 000×g离心20 min,无菌生理盐水清洗菌泥2次,倾注法调整总活菌量在109CFU/mL,用10%脱脂乳作为保护剂,将菌液冻存在-80 ℃备用；灌胃前将菌液于4 ℃、6 000×g离心3 min,用无菌生理盐水重悬后使用。

1.3 动物实验及方案设计

1.3.1 动物饲养

雄性C57BL/6 J实验小鼠(5周龄,SPF级,体质量18～20 g)购于苏州格瑞斯威公司。动物实验方案获得江南大学实验动物实验伦理委员会批准(伦理编号为：JN.No20190330c0840522)。实验鼠饲养于屏障系统中,环境温度为(23±2) ℃,相对湿度为(50±10)%,光照模式为12 h∶12 h昼夜交替。

将24只实验小鼠随机分为空白组、慢性应激组和益生菌干预组,每组8只。适应性饲养1周后,除空白组外,其余2组小鼠采用慢性不可预知温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)[13]造模4周。造模期间,益生菌干预组小鼠给予每只109CFU/d的复合乳酸菌悬液,其余2组小鼠每天灌胃0.2 mL的10%脱脂乳。从第36天开始,开展行为学测定。第40天进行小肠推进率实验、处死小鼠并取材。

图1 动物实验方案设计Fig.1 Design for animal experiments

1.3.2 糖水偏好实验(sucrose preference test,SPT)

参考ZHANG等[14]报道的方法。实验开始前对实验鼠进行24 h的糖水适应,结束后禁水禁食24 h。正式实验时,同时放置纯水和1%的蔗糖水,每隔3 h记录1次纯水和糖水的消耗量。为避免实验鼠的饮水习惯带来的干扰,每隔1 h调换1次水瓶的位置。

(1)

1.3.3 高架十字迷宫实验(elevated plus maze test,EPM)

参考TIAN等[2]报道的方法。将实验鼠面向开放臂放入高架十字迷宫的中心区域,摄像机记录实验鼠6 min内的运动轨迹,为减少气味信息等干扰,每次实验结束后用75%的酒精擦拭迷宫的四臂。分析实验鼠在开臂停留的时间及进入开臂的频率。

1.3.4 强迫游泳实验(force swim test,FST)

参考DESBONNET等[15]报道的方法。将实验鼠放入在5 L烧杯中[水深10 cm,水温为(23±2 ℃)],摄像机记录6 min内小鼠的运动情况,分析实验鼠在水中的静止时间。

1.3.5 首粒黑便测定

参考王琳琳等[16]报道的方法。开始实验前,对实验鼠禁食12 h,然后灌胃0.2 mL的墨汁,记录完成灌胃以及排出首粒黑便的具体时刻,计算获得首粒黑便的时间。

1.3.6 粪便含水率测定

参考XU等[17]报道的方法。每只实验鼠单独放入代谢笼中,收集粪便(>5粒)于1.5 mL EP管中,称量粪便的湿重,充分冻干后记录粪便的干重。

(2)

1.3.7 小肠推进率测定

参考NAGAKURA等[18]报道的方法。对实验鼠进行12 h的禁食处理后,每只实验鼠被灌胃0.2 mL的墨汁,30 min后处死小鼠,完整剪下小鼠的幽门到盲肠段组织,测量小肠的总长度和墨汁从胃幽门端向盲肠推进的长度。

(3)

1.3.8 神经递质及其前体的测定

采用高效液相-荧光检测系统测定小鼠前额叶皮质以及结肠中5-HT和L-Trp的浓度,参考杨佳丽等[19]建立的方法。组织与无菌生理盐水按1∶9(g∶mL)进行匀浆,组织液在4 ℃、12 000 r/min离心15 min,取100 μL上清液,加入等体积的5%(质量分数)高氯酸以沉淀蛋白,同条件下离心,将上清液过0.22 μm玻璃滤器,转移至液相小瓶待上机检测。使用C18色谱柱分离。流动相A为0.1 mol/L的乙酸钠溶液,B相为纯甲醇,流动相比例为85∶15(A∶B),检测发射波长为330 nm,激发波长为290 nm。

1.3.9 血清皮质酮和炎症因子的测定

全血静置2 h,3 500 r/min离心15 min,收集上层血清。ACTH、CORT与TNF-α、IL-1β的测定方法采用酶联免疫法,具体实验步骤依循试剂盒说明书。

1.3.10 结肠Htr4基因表达量的测定

以Gapdh为内参基因,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定受体Htr4的基因表达量。采用Trizol裂解组织以提取结肠样本的RNA,经逆转录制备稳定性更高的模板DNA。在Bio-Rad CFX384 PCR仪器上进行定量分析,反应体系为10 μL,每个样品重复3次,采用2-ΔΔCt分析。所使用基因序列来自于Primer Bank,相关信息见表1。

表1 Gapdh、Htr4基因引物序列Table 1 Gapdh,Htr4 gene primer sequence

1.3.11 短链脂肪酸的测定

实验方法在毛丙永等[20]的方法上进行合理改进。采用GC-MS测定小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸的含量。盲肠内容物经过冷冻干燥后记录干重,加入饱和NaCl溶液浸泡,均质机粉碎后加入10%的硫酸酸化,经过无水乙醚浸提之后,将上层有机相转移至装有无水硫酸钠的EP管,离心充分吸收水分,取上层溶有短链脂肪酸的有机清液,装入气相瓶进行检测。采用外标法建立6种短链脂肪酸的标准曲线,根据特征峰面积计算各类短链脂肪酸的含量。

1.4 数据统计与分析

数值均表示为平均值±标准差(Mean±SD)。实验结果采用GraphPad Prism 8作图,空白组与慢性应激组、益生菌干预组与慢性应激组进行非配对t检验,P<0.05代表组间具有统计学差异。以符号区分显著性等级,其中*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。相关性分析采用Pearson’s相关性系数(r值)进行评价。

2 结果与分析

2.1 益生菌缓解慢性应激导致的小鼠行为异常

持续4周的慢性应激导致实验鼠呈现出显著的抑郁状态。采用经典的强迫游泳实验和糖水偏好实验对小鼠的抑郁样行为进行评价,结果如图2所示。与空白对照组相比,慢性应激小鼠在强迫游泳实验中静止不动的时间显著升高(P<0.001),对糖水的摄入率显著降低(P<0.01)。由于焦虑与抑郁在临床上具有高度并发性[21],进一步采用高架十字迷宫实验对小鼠的焦虑样行为进行评价。结果表明,慢性应激小鼠在开放臂停留的时间和进入开放臂的次数(P<0.001)均降低,表现出典型的焦虑样表型。与慢性应激小鼠相比,复合乳酸菌干预治疗可以显著降低小鼠在强迫游泳中的静止时间(图2-a,P<0.01),提高其糖水偏好度(图2-b,P<0.01),并增加小鼠进入开放臂频率(图2-c,P<0.01)。

a-强迫游泳实验; b-糖水偏好实验; c-高架十字迷宫实验图2 行为学测试结果Fig.2 Results of behavioral tests

2.2 益生菌能够改善慢性应激导致的便秘

在首粒黑便和小肠推进率的实验中,相比于正常小鼠,慢性应激小鼠排出首粒黑便的平均时间滞后了近80 min,且小肠推进率由75%降低为44%。小肠推进率可以反应小肠的运动能力,而首粒黑便可以模拟食糜在整个肠道中的运动时间[4]。这表明慢性应激诱发实验鼠出现典型的便秘症状。早期的临床研究发现,约27%的重度抑郁患者通常会伴随便秘症状[22]。此外,张郭莺等[6]采用慢性不可预知温和刺激实验鼠,也观察到典型的抑郁和便秘症状。益生菌干预可以改善小肠蠕动减慢的现象(图3-b,P<0.01),加快食糜的传输速率,进而缩短首粒黑便的排出时间(图3-a,P<0.05)。此外,通过粪便含水率对粪便的干结程度进行分析,发现慢性应激可导致小鼠粪便含水率显著降低(图3-c,P<0.01),而补充复合乳酸菌后,可使得模型鼠的粪便含水率提高约14.5%,这也表明复合乳酸菌能够润肠通便,具有缓解便秘的潜力。

a-首粒黑便实验;b-小肠推进率实验;c-粪便含水率实验图3 表观便秘指标测试结果Fig.3 Results of apparent constipation index

2.3 益生菌对应激导致的神经生理学异常的改善作用

大脑中5-HT的缺乏是导致抑郁症的主要原因之一[23]。目前,临床一线抗抑郁药物——选择性5-HT重摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitor,SSRI),主要通过抑制神经元对5-HT的重吸收,从而提高突触间隙的5-HT水平[24]。结果表明,慢性应激小鼠前额叶皮质中5-HT含量显著降低(图4-a,P<0.05),这可能是导致小鼠出现抑郁样行为的直接原因。前额叶皮质是参与情绪调控和认知的重要脑区,广泛参与对宿主情绪、睡眠、痛觉等神经活动的调控。服用复合乳酸菌能够使应激小鼠前额叶皮质中的5-HT、L-Trp(5-HT合成前体)的水平显著上调(图4-a,P<0.000 1；图4-b,P<0.05),这提示益生菌可能通过加速外周的L-Trp进入前额叶来促进脑部5-HT的合成,进而发挥抗抑郁功效。

a-前额叶皮质5-HT水平;b-前额叶皮质L-Trp水平;c-前额叶皮质TNF-α水平d-前额叶皮质IL-1β水平;e-血清皮质酮水平;f-血清促肾上腺皮质激素水平图4 复合益生菌对抑郁理化指标的缓解作用Fig.4 Effects of multi-probiotics on biochemical indicators of depression

除此之外,应激小鼠的前额叶皮质中TNF-α和IL-1β含量升高(图4-c,P<0.01;图4-d,P<0.05)。与此同时,其血清中ACTH和CORT的含量也显著升高(图4-e,P<0.05；图4-f,P<0.05)。这表明应激小鼠出现下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA axis)功能亢进。HPA轴是神经内分泌系统的重要部分,参与控制应激的反应,并调节许多身体活动,如消化、免疫、情绪、性行为以及能量代谢等。大量研究已经证明,HPA轴亢进及其伴随的免疫系统失调,是抑郁症发生和发展的重要因素之一[1]。SAPOLSKY等[25]发现,小鼠和猴子在补充过量CORT的情况下,其海马和前额叶出现萎缩,进而导致脑功能受损；WERMERSKIRCHEN等[26]采用ACTH刺激刀豆蛋白(concanavalin A,ConA)激活的淋巴细胞,发现其促炎因子IL-2的分泌量显著提高。临床研究也表明,与健康对照相比,抑郁症患者具有更高的血清皮质醇水平[27]。PERRIN等[28]基于15项临床试验及11项动物实验中的荟萃分析表明,糖皮质激素水平的升高通常伴随着促炎因子水平的上调。在采用复合乳酸菌干预后,应激导致的HPA轴功能亢进和炎症均得到有效逆转,并趋于正常的水平(图4-c～4-f)。

进一步对益生菌干预的小鼠的行为学和神经生理学检测进行相关性分析(图5)。结果表明,前额叶IL-1β与小鼠的抑郁样行为有显著相关性(FST不动时间：r=0.6,P<0.05；EPM开放臂进入频率：r=-0.5,P<0.05)；类似的,血清皮质酮水平也与抑郁样行为呈现显著相关性(FST不动时间：r=0.43,P<0.05；EPM开放臂进入频率：r=-0.53,P<0.05)。而血清皮质酮水平与前额叶5-HT含量呈显著负相关性(r=-0.53,P<0.05)。

图5 行为学与神经生理学指标相关性分析Fig.5 Pearson’s correlation analysis among the behavioral and neurobiological dataset

这些结果进一步表明,缓解HPA轴功能亢进及其伴随的炎症,是复合乳酸菌发挥抗抑郁功效的关键机制。

2.4 益生菌缓解便秘的机制探究

便秘是一种常见的胃肠道疾病,其主要症状为排便困难、排不尽感、排便频率低、排便时间长以及粪便干结[29]。便秘的发病原因复杂,与不良生活习惯、肠道病变、药物滥用以及精神心理因素等密切相关。研究表明,胃肠道动力不足会导致小肠运动减缓,从而引发便秘；5-HT作为重要的神经递质,不仅参与中枢神经系统诸多功能,而且在肠神经系统中也扮演着重要角色。肠嗜铬细胞分泌的5-HT能够刺激上行性中间神经元释放P物质、降钙素基因相关肽,这些胃肠道激素作用于兴奋性运动神经元,引起肠道环形收缩,增加肠道动力[3]。在本实验中,益生菌干预组结肠中5-HT的水平显著上调(图6-a,P<0.01),表明益生菌可能通加速结肠平滑肌的运动,从而缓解模型鼠的便秘症状。

近期一项研究表明,阻断肠黏膜及黏膜下层的5-HT分泌,并不能阻止扩张引起的蠕动[30]。这说明5-HT并不是参与调节肠道蠕动的唯一要素。陈小燕等[31]发现,5-HT4受体拮抗剂——哌波色罗能够抑制肠神经元释放乙酰胆碱,减缓胃肠动力；与之相反,新型5-HT4受体激动剂——米沙比利DSP-6952,可以提高胃肠道的蠕动能力,增加排便的频率[32]。这些研究直接印证了5-HT4受体对于胃肠道蠕动的重要意义。由图6-b可知,慢性应激可以导致小鼠结肠5-HT4受体的基因表达量显著降低(P<0.01),而在补充复合乳酸菌后,这种异常得到恢复(P<0.01)。

a-结肠5-HT水平;b-结肠Htr4基因表达量;c-粪便含水率d-GC-MS测定短链脂肪酸;e-盲肠内容物中6种短链脂肪酸水平图6 复合益生菌对便秘理化指标的缓解作用Fig.6 Effects of multi-probiotics on biochemical indicators of constipation

除此之外,图6-e的实验结果表明,补充复合乳酸菌可以显著提高应激小鼠盲肠中短链脂肪酸的含量,包括乙酸(P<0.05)、丙酸(P<0.000 1)、丁酸(P<0.001)、异丁酸(P<0.001)、戊酸(P<0.01)和异戊酸(P<0.05)。与此同时,应激导致的粪便含水率降低也得到了显著逆转(图6-c,P<0.05)。短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)是肠道厌氧微生物在结肠内发酵碳水化合物所获得的一类饱和脂肪酸。乙酸、丙酸、丁酸是3种主要的短链脂肪酸,大约占总量的90%～95%[33]。临床研究发现,慢性便秘和功能性便秘患者的粪便中,SCFAs的总量降低[34-35]。HURST等[36]采用结肠管腔注射的方式,分别为豚鼠补充乙酸盐和丁酸盐,证明乙酸和丁酸可促进结肠蠕动。类似的,王琳琳等[16]给予洛哌丁胺诱导的便秘模型小鼠乙酸、丙酸和丁酸治疗,发现单酸和混酸均能改善小鼠的粪便水分含量和肠蠕动性。MACFARLANE等[37]的研究表明,肠道SCFAs水平的升高,能够增加粪便中Na+、K+的含量和渗透压,从而增加粪便含水量,进而缓解便秘症状。我们的结果与之前报道一致。

2.5 肠源L-Trp参与益生菌介导的抑郁和便秘的缓解

考虑到L-Trp/5-HT代谢在中枢神经系统和肠神经系统的中的关键作用,检测了结肠中L-Trp的含量,并对益生菌干预小鼠的结肠L-Trp和脑L-Trp/5-HT进行相关性分析,如图7所示。结果表明,慢性应激造成了小鼠肠道结肠L-Trp含量的降低,但服用益生菌无法逆转这种异常。然而,结肠L-Trp的含量和前额叶皮质中5-HT的含量呈显著正相关(r=0.861 8,P=0.012 6；与前额叶皮质中L-Trp含量正相关,但无统计学差异(P=0.059 0)。

a-结肠L-Trp含量;b-结肠与前额叶皮质L-Trp含量的相关性;c-结肠L-Trp与前额叶皮质5-HT含量的相关性图7 肠源L-Trp含量及其肠-脑相关性分析Fig.7 Intestinal L-Trp level and concentration analysis between gut and brain L-Trp levels

肠道是人体5-HT合成的主要来源。肠嗜铬细胞能够分泌机体约95%的5-HT,但由于血脑屏障的存在,外周神经系统的5-HT无法穿越血脑屏障进入大脑。然而,必需氨基酸L-Trp作为5-HT的前体物质,能够穿过血脑屏障,进而影响脑部5-HT的生物合成[38]。研究表明,在急性L-Trp耗竭状态下,机体脑部的5-HT生物合成显著降低,并诱发抑郁症状[39-40]。结合这些研究背景和本文的结果,我们认为肠源色氨酸缺乏与抑郁的形成密切相关,而益生菌对肠道和大脑L-Trp/5-HT合成的调控,可能是益生菌缓解便秘和抑郁的共同机制。

3 结论

本研究对复合乳酸菌制剂(包含BifidobacteriumbreveCCFM1025、BifidobacteriuminfantisCCFM687和PediococcusacidilacticiCCFM6432)的健康功效进行评价。慢性应激导致小鼠出现典型的抑郁症状,而补充该复合乳酸菌制剂能够通过提高小鼠脑中神经递质(L-Trp、5-HT)、降低HPA轴应激激素(ACTH、CORT)和脑中炎症因子(TNF-α和IL-1β)的水平,实现对抑郁的缓解作用。此外,该复合乳酸菌制剂还能提高小鼠结肠5-HT、Htr4基因转录以及肠道短链脂肪酸的水平,显著缓解应激小鼠的便秘症状。益生菌对肠道和大脑L-Trp/5-HT合成的调控,可能是益生菌缓解便秘和抑郁的共同机制,本研究证实了该复合乳酸菌作为精神益生菌的潜力,也为抑郁症及其伴随胃肠道功能紊乱的治疗提供了新的思路。