新兴技术在沙丁胺醇残留检测中的应用进展*

李红杰

（天津大学 药物科学与技术学院，天津300072）

β－兴奋剂（β-agonist）全称是β－肾上腺素兴奋剂，或又称β－激活剂，是一种苯乙醇类衍生物（分子结构见图1），在临床中主要用于治疗哮喘等支气管类疾病，后来被用于畜禽行业，提高牲畜的瘦肉率，β－兴奋剂类物质代谢后易在动物内脏器官内残留，进而引起了屡禁不止的食物中毒事件，因此，成为了国内外禁用的化学物质之一。常见的β－兴奋剂种类包括克伦特罗，沙丁胺醇，莱克多巴胺等，在其中代谢最快、最不易被检测到的物质即为沙丁胺醇（Salbutamol，SAL）[1]。

沙丁胺醇（分子式：C13H21NO3）属于苯胺类物质，又称为舒喘宁，化学名称为1-（4-羟基-3-羟甲基苯基）-2-（叔丁氨基）-乙醇（分子结构见图1），其硫酸盐易溶于水，在体内较克伦特罗等更易被代谢，从而增加了后期药物的检测难度。全文综述了沙丁胺醇类兴奋剂残留的检测现状，除了沙丁胺醇等物质的前处理方法总结外，还分别从化学，生物，代谢产物等方面，综述了新兴技术在沙丁胺醇残留最新检测方法中的应用，并对其检测前景做出预测，为沙丁胺醇等β－兴奋剂违规使用的检测研究提供了有效依据。

图1 β－兴奋剂和沙丁胺醇的分子结构Fig.1 Structural formula of β - agonists and salbutamol

1 沙丁胺醇残留物的检测现状

为了严格控制各种β－兴奋剂的违规使用，建立快速，简便，有效的残留物检测方法是化学、生物研究领域的重点问题。常见的检测方法包括酶联免疫吸附法（ELISA）、气相色谱法-质谱联用法（GCMS）、液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）、高效液相色谱法（HPLC）和毛细管电泳分离检测法（CZE）等，在快速检测方法中，已经有多种试剂检测盒，试剂检测试纸应用于药物的快速检测，胶体免疫金层析法近几年被广泛用于药品、食品的检测中，主要是用胶体金标记样品中的生物大分子，将色谱层析技术和免疫抗原抗体的特异性反应二者相结合的一种检测技术。韩京朋等[2]制备的用来检测尿液中沙丁胺醇残留的胶体金免疫试纸条，检测限已经降低至3.0μg·L-1，可在5min 内快速鉴定出肉眼可识别的结果，被用于现场定性和半定量检测和快速筛选。吴雨豪等[3]建立了胶体金免疫层析新方法，通过制备65nm 多枝状胶体金（金纳米花）新型探针来检测猪尿中的沙丁胺醇，最低检测限降低至0.027ng·mL-1。胶体金免疫层析法成本低且快速，但是会出现假阴性、假阳性等现象。另外，郑宏伟等[4]建立了简便、快速、灵敏度高的沙丁胺醇ELISA 试剂盒检测技术，此检测试剂盒的最低检测限为0.1×10-9，适用于大批量样品中沙丁胺醇的现场快速检测。这些方法在化学、生物分析领域，以及药物残留的检测中较常见，于是全文对这几种方法将不再展开多余的阐述，仅仅针对新兴技术产业在沙丁胺醇残留检测方法的应用进行简要介绍。

2 沙丁胺醇残留的前处理

沙丁胺醇等药物残留的前处理方法，与蔬菜中农药残留分析相比，相对快速简单的前处理方法所用有限。在检测中也多使用在农药残留中常见的固相微萃法（SPME），液-液萃取技术（LLE）、基质固相萃取技术（MSPD）等方法。最近几年，另外几种前处理方法也见于兽药残留检测如沙丁胺醇中，如QuECHERS （Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）技术，分子印迹分析技术，酶解法等。QuECHERS 技术通过选用合适的具有吸附作用的吸附剂对药物或者杂质进行吸附，作用原理与高效液相和固相萃取技术类似，但是更好的提高了目标分辨率和灵敏度，增强了方法的实用性[5]。郑玲等[6]采用QuEChERS 方法进行沙丁胺醇等18 种β－兴奋剂的检测前处理，通过优化QuEChERS 方法过程中试剂条件，如将QuEChERS 方法中常用乙腈或酸化乙腈等提取试剂优化成了4%（v/v）氨水乙腈、将PSA、C18及石墨化炭黑（GCB）等常用的吸附剂通过实验组合成25mg C18+50mg PSA 的净化剂等，同时将一些质谱仪器条件也进行了优化，这些改变不仅提高了回收率，而且提高了整个检测过程的灵敏度和效率。在样品前处理过程中，分子印迹法（MIT）也常常发挥其高亲和力、高特异性和高稳定性等优势。另外，赵文成等[7]采用酶解法对样品进行前处理，通过对酶解时间、温度以及衍生化条件等进行一系列实验细节优化，得到了8h 的最佳酶解时间、40℃最佳酶解温度，从而在沙丁胺醇等一系列β-兴奋剂的检测实验中获得了较高的提取率。

3 沙丁胺醇残留的最新检测方法

3.1 化学检测

3.1.1 化学分析法 化学分析法是化学成分检测中常见的分析途径，由于操作简单、准确度高、设备成本低等优点而被人们广泛使用，在常量元素的分析测定方面更是具有方便快捷的特点[8]。在农药残留成分检测中常见的是滴定分析，如EDTA 络合滴定法。兴奋剂类药物残留常见于动物肌肉，血液，尿液，毛发等排泄物中，肌肉等组织构造复杂，代谢产物繁杂等增加了化学分析法检测的难度，在兽药成分残留的检测中，以及农药残留检测中常用的化学滴定法并不常用，这些易操作的化学分析检测方法在兽药残留成分的检测中仍有待发展。

化学发光检测也是化学分析中重要的研究手段，通过建立化学发光体系，以及一系列化学发光物质进行化学成分的检测已经成为了实验室的关于β－兴奋剂的研究热点。董晓等[9]通过建立Ni（IV）-鲁米诺流动注射化学发光体系，在碱性条件下，对鲁米诺溶液浓度和碱度、Ni（IV）溶液浓度和碱度进行了优化，分别测定了沙丁胺醇在硫酸盐，尿液和饲料中含量，并且确定沙丁胺醇检测限范围为1.0×10-9～5.0×10-7mol·L-1，检出限为1.0×10-11mol·L-1。这种建立化学发光体系的检测方法简单，快速且灵敏，可被广泛应用于化学和生物领域。

3.1.2 仪器分析法 在光谱分析中，红外光谱分析法，紫外光谱分析法，荧光传感器检测技术和分光光度检测技术被广泛应用于各类β－兴奋剂的检测方法中。红外光谱分析法是一种借助红外光谱特征谱图对沙丁胺醇等药物残留进行分析、鉴定的无损化技术。与其他的检测技术相比，红外光谱分析法无需样品前处理过程，具有操作快速简洁，准确等优点，现广泛被用作农兽药残留检测的分析手段。

在色谱检测方法中，通常用到的色谱方法有气相色谱法，液相色谱法，薄层色谱法，高效液相色谱法，毛细管电泳法等。色谱法在沙丁胺醇等残留的检测中发展较为成熟，如色谱-质谱联用技术作为一种广泛被应用于药物残留检测的分析方法具有灵敏度高，可以很快的定性定量等优点。普通的液相色谱-串联质谱联用分析方法可以用于不超过几十种药物的检测，对于高通量药物的筛选，田怀香[10]等利用一种高效液相色谱-串联飞行时间质谱（HPLC-TOFMS /MS）联用的化学分析方法检测了乳制品中包括β-兴奋剂类、大环内酯类、非甾体类消炎药等174种兽药品的残留，通过Poroshell 120 EC-C18柱进行分离，以及0.1%甲醇和甲酸流动相进行洗脱后采用正离子模式进行采集，可将检测限降低为1～10ng·g-1，同时质控样品种类数目可达99 种，这种高通量筛选的方法不仅提高药物检测的灵敏度，而且大大提高乳制品中药物残留筛选的效率。但是各种色谱法中使用的仪器设备较为昂贵，且对专业人员的技术操作有一定的要求，因此，色谱法多用于实验室精密检测，在沙丁胺醇等兽药残留的现场快速检测中应用较少。

3.2 生物检测

生物检测除了80 年代以来常用到的酶抑制法（EI），胶体金免疫层析法（CGIA），化学发光免疫分析法（CLIA）、荧光免疫分析法( FIA)、放射免疫层析法( RIA)等免疫分析技术[11]外，20 世纪以来又新增了生物传感器技术，新型生物芯片技术，单克隆抗体等检测方法。

3.2.1 生物传感器（biosensor, BS）技术 生物传感器技术是一项多学科交叉使用的新型微量分析技术，在快速检测技术上表现出巨大的发展优势。它通常以酶，抗原抗体，细胞等活性敏感材料作为识别元件，经过一系列浓度反应变化后转换成相应的电信号，呈现在传感器中并显示记录下来[12]。生物传感器分为电化学传感器，光纤传感器等。如单学凌等[13]采用RuSiNPs/SnO2复合膜去修饰玻碳电极，制备了一种增敏型电化学发光生物传感器来检测沙丁胺醇残留成分，显著的提高了分析灵敏度。虽然生物传感器具有很高的灵敏度和稳定性，但是检测范围较狭窄，仅应用于单一成分的检测。生物传感器技术与计算机相结合，实现进样，检测分析等自动化是生物传感器技术未来的发展方向。

3.2.2 生物芯片（biochip）技术 生物芯片技术是应用玻璃片，硅片等材料固定样本，然后通过微加工技术对蛋白质，核酸等一系列大分子进行检测的新兴技术。在20 世纪末开始使用的新型生物芯片产品——液相芯片技术是一种基于荧光微球探针的多功能分析技术，主要有灵敏度高、检测速度快等优点，既可以对大量样品进行分析，又扩大了样品中的筛选范围。梁世正等[14]利用液相悬浮芯片技术同时检测了莱克多巴胺、盐酸克伦特罗和沙丁胺醇3 种β-兴奋剂的残留成分，分别用3 种药物抗原偶联到不同的荧光微球上作为探针，将藻红蛋白（PE）荧光标记二抗作为信号，通过建立标准曲线分别同时检测3 种药物，其中沙丁胺醇的检测范围是1～100μg·L-1，检出限0.88μg·L-1，这种方法的特异性较强且通量高，故可用于多成分的残留检测。近年来，我国在生物芯片技术领域取得了一定的突破性进展，其在农兽药安全检测方面，具有广阔的应用前景。

3.3 首要代谢产物的检测

沙丁胺醇在人体中主要的代谢途径是通过与硫酸盐结合从尿液中排出体外。从沙丁胺醇代谢物残留的角度去分析与检测，通过选择合适的靶标和标记物监测沙丁胺醇的代谢残留物也不失为一种检测途径。Kai Zhang 等[15]通过UHPLC-QTOF-MS/MS 监测了牛的体液和肾脏等器官中沙丁胺醇的10 种代谢产物，虽然发现6 种最新的代谢产物，但是10 种代谢产物中均未发现与硫酸盐结合的产物，分析可能是动物肠道的微生物所具有的复杂的消化特质导致的。这种检测结果说明在沙丁胺醇的检测中，检测标记物选取母核药物或总结合药物残留由选取的不同个体决定，这类研究在沙丁胺醇代谢物残留的检测中具有一定参考价值。

3.4 其他检测方法

3.4.1 电化学检测 电化学检测方法通过改变化学电池、化学电极的参数，来监测溶液浓度的变化进而达到检测的目的。在沙丁胺醇残留成分的检测中，电化学法往往通过改变电极修饰材料的方法而提高检测的灵敏性。分子印迹法（MIT）凭借其简单的制备方法和优良的理化性质被广泛应用于多种分子的电化学检测方法中，任慧鹏等[16]应用改良后的电化学传感方法对沙丁胺醇进行检测，通过对分子印迹膜（MIM）电流型传感检测、TCNQ 胶体金电流型传感检测、MIM 电导传感检测法、石墨烯-纳米金等4 种修饰电极的方法进行比较后发现，沙丁胺醇分子印迹膜（MIM）修饰电极的电导传感检测法最具使用价值，检测限范围为0.5～15mg·L-1，检测下限可降至0.03mg·L-1，可以应用于大批量的沙丁胺醇的现场检测工作中。杜平等[17]利用纳米金和硫堇的良好导电性能来对玻碳电极表面进行了修饰，制成了纳米金/聚硫堇/沙丁胺醇分子印迹电化学传感器，这种类型的电化学传感器特异性强，具有很强的抗干扰能力。电化学检测法灵敏度较高，但是检测过程中用来修饰电极的材料普遍特殊，需要较高的专业操作技术，所以不易推广。

3.4.2 材料改造型检测 在材料工程方面，随着纳米材料的发展，多学科交叉的快速检测方法在基于纳米材料改造技术上的发展趋势日益明显，纳米结构型材料逐渐被应用于各种实用的检测方法中，例如碳纳米管快速检测法，表面等离子体共振（SPR）生物传感器等检测方法。在传统的拉曼散射（SERS）芯片衬底材料中，一般使用表面等离激元活性较强的Au、Ag 等贵金属材料，而班榕柽等[18]采用了TiN等激元活性材料后，成功的制备出TiN/Ag 双壳层阵列结构芯片，提高了SERS 芯片检测的灵敏度和稳定性，明显拓宽了生物检测的检测域，同时在沙丁胺醇等β－兴奋剂的检测中也得到了很有效的应用，通过比较SERS 芯片检测方法和色谱-质谱联用技术各自获得的回收率，进一步分析得出了SERS 芯片检测的可行性和实用性。王晨晨等[19]利用金属纳米材料的稳定性高，可塑性佳，且生物相容性好等优点制备了表面离子共振生物传感器，利用沙丁胺醇抗原抗体相互作用的原理展开了沙丁胺醇残留的现场快速检测，检出限为1.2ng·mL-1。Malahom 等[20]在采用新型纸基比色免疫测定法（PCI）测定猪尿液中沙丁胺醇残留时，利用Ag3PO4/Ag 纳米复合材料与反应底物的亲和性，将Ag3PO4/Ag 纳米复合材料作为标记材料提高了纸基ELISA 方法的灵敏性和特异性。纳米材料等材料改造型检测与其他检测方法的交叉使用，将成为沙丁胺醇等药物残留检测方法未来发展的主要趋势。

4 展望

沙丁胺醇等药物的长期使用将引起心脑血管等一系列问题，甚至致死。各地政府均对沙丁胺醇的使用量进行了明确规定，如WHO 规定沙丁胺醇的最大残留量不超过0.2μg·kg-1，在中国，政府严禁在畜牧业中使用沙丁胺醇等药物。因此，沙丁胺醇残留的检测具有很深刻的研究意义。沙丁胺醇残留的常见检测方法如色谱法，酶联免疫法，免疫分析法等，操作过程复杂，检测成本偏高，而且有些方法不能对样品成分进行立即准确的验证，现在各种新兴的检测方法越来越趋向于多学科技术的交叉融合，例如色谱法和质谱法的联用，免疫法和层析技术的结合，以及生物传感技术与多种技术的结合使用，多种方法的联合使用不仅可以克服单一技术的不灵敏性，而且可以扩大检测范围，降低检测限。因此，建立具有检测耗时短、灵敏度高、自动化水平高、无需专业人员操作等特点的检测方法，是沙丁胺醇以及其他新型β－兴奋剂残留检测方法的最新发展方向。