星点设计-效应面法优化二氢槲皮素提取工艺*

逄弓一郎，卓小玉，刘玉婷，田 明

（黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040）

二氢槲皮素因具有抗肿瘤、抗氧化、抗辐射、抗病毒、抗心血管系统疾病、改善毛细血管微循环、改善脑部血液循环、抗血小板凝聚等作用，用于治疗脑梗及其后遗症、脑血栓、心脏冠状动脉等疾病,为近年来广泛研究[1]。俄罗斯西伯利亚落叶松材料广泛、消耗量大，近些年逐渐成为生产工业原料，其废料利用率低，本实验以贴合生产实际考虑废物利用，以原落叶松废料为主从中提取二氢槲皮素，考察原料经后处理加热时间、提取用乙醇用量、浓度、时间、次数多因素对其二氢槲皮素提取含量的影响，采用单因素实验与星点实验对比，对二氢槲皮素提取流程优化，以HPLC 色谱法快速、准确对二氢槲皮素含量进行测定。星点设计效应面法是优化实验流程的常用方法，基于非线性模型设计预测性高，方法高效、简便[2]。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

FW135 型中药粉碎机（天津泰斯特实验仪器有限公司）；DZTW 型调温电热套（北京永光明实验设备有限公司）；AB204-N 电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；Thermo-Sciencetific Ultimate3000 高效液相色谱仪（配有四元泵、在线脱气装置、柱温箱、控温自动进样器和UV 检测器，美国Thermo 公司）；超声波清洗机（MP5200H，陕西鹏展科技有限公司）。

落叶松（俄罗斯）；二氢槲皮素对照品（批号：PS000323 成都普思生物科技有限公司）；乙醇、甲醇、甲酸均为色谱纯；实验用水为纯化水。

1.2 方法

1.2.1 二氢槲皮素含量测定方法的建立

1.2.1.1 色谱条件 二氢槲皮素含量测定采用高相液相法，色谱条件色谱柱AgilentZORBAX SBC18，250mm×4.6mm 流动相为甲醇-甲酸（0.15%）；波长290nm；流速1.0mL·min-1；柱温28℃；进样量10μL。

1.2.1.2 溶液的制备

对照品溶液 电子天平称取二氢槲皮素对照品精密称定（15.0mg），置10mL 容量瓶中，加色谱甲醇定容摇匀，用0.45μm 的微孔滤膜过滤即得（约1.50mg·mL-1）。

供试品溶液 精密称取供试品细粉15g，加入甲醇5mL 超声30min，冷却至室温，用0.45μm 微孔滤膜过滤即得。

1.2.2 单因素考察

1.2.2.1 提取条件 称取落叶松适量，粉碎过8 目筛，称取20g，6 份，分别加100mL 50%、60%、70%、80%、90%、95%的乙醇浸泡1h 后，加热回流提取2次，每次1h，滤过，合并滤液，用各自乙醇浓度定容在100mL 容量瓶中，用0.45μm 微孔滤膜过滤1mL，HPLC 法测定含量。

色谱条件 色谱柱AgilentZORBAX SB-C18，250mm×4.6mm，5μm；流动相为甲醇-甲酸（0.1%）；波长290nm；流速1.0mL·min-1；柱温35℃；进样量10μL。

1.2.2.2 溶剂用量 称取落叶松粗粉20.0g，5 份，分别加4、6、8、10、12 倍量80%乙醇浸泡1h 后，加热回流提取2 次，每次1h，滤过，合并滤液，用80%乙醇定容在100mL 容量瓶中，用0.45μm 微孔滤膜过滤1mL，HPLC 法测定含量。

1.2.2.3 提取时间 称取落叶松粗粉20.0g，5 份，加100mL 80%乙醇浸泡60min 后，分别回流提取60、90、120、150、180min 后，滤过，用80%乙醇定容在100mL 容量瓶中后，用0.45μm 微孔滤膜过滤1mL，HPLC 法测定含量。

1.2.3 星点试验

提取工艺优化应用的是星点设计效应面法，以此优化落叶松在乙醇提取的条件下最优方案。根据“1.2.2”项下因素水平筛选结果，最终选乙醇浓度80%～95%（X1）、溶剂用量4～10 倍（X2）、提取时间1.5～3h（X3）为考察因素水平。由于提取次数为非连续变量，在星点设计处理结果模型拟合中比较困难，再结合单因素考察结果[3]，把提取次数定为2 次，分别测定二氢槲皮素质量分数，取其平均数作为响应值，优选提取工艺。

2 结果与讨论

2.1 单因素考察结果

2.1.1 提取条件对二氢槲皮素含量的影响 在乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%、95%浸泡药材1h，加热回流提取2 次，每次1h 的条件下，考察提取液乙醇不同浓度对落叶松中二氢槲皮素的含量影响。结果见表1、图1。

表1 不同乙醇浓度提取二氢斛皮素含量测定结果Tab.1 Determination results of dendrobium dendrobium content extracted by different ethanol concentrations

图1 不同乙醇浓度含量测定结果Fig.1 Determination results of different ethanol concentrations

结果表明，浓度为80%到95%的差异不显著，RSD 值接近5%，综合考虑试剂用量，避免造成试剂浪费等因素，所以选择提取液乙醇浓度80%为适宜浓度。

2.1.2 溶剂用量对二氢槲皮素含量的影响 在加入4、6、8、10、12 倍量80%乙醇浸泡药材1h 后，加热回流提取2 次，每次1h 的条件下，考察提取液乙醇不同用量对落叶松中二氢槲皮素的含量影响。结果见表2、图2。

表2 不同溶剂量提取二氢斛皮素含量测定结果Tab.2 Determination results of dihydrodendrobin content extracted with different solvent amounts

图2 不同乙醇用量含量测定结果Fig.2 Determination results of different amounts of ethanol

结果表明，落叶松中二氢槲皮素的含量随着提取液用量的增加而增大，当溶剂用量为12 倍量时，二氢槲皮素的提取效果与10 倍量提取量几乎一样，说明无差异，故确定提取液用量为10 倍量。

2.1.3 提取时间对二氢槲皮素含量的影响 在回流提取时间分别为1、1.5、2、2.5、3h 的条件下，考察提取时间对落叶松中二氢槲皮素的含量影响。结果如表3、图3。

表3 不同提取时间对二氢斛皮素含量测定结果Tab.3 Determination results of the content of dihydrodendrobin at different extraction times

图3 不同提取时间量含量测定结果Fig.3 Determination results of different amounts of extraction time

结果表明，二氢槲皮素的含量随着回流提取时间增大而增大，在加热回流2h 后趋于平缓，考虑实验时间因素，故选择回流提取时间2h 最为适宜。

2.2 星点实验结果

根据“1.2.2”项下因素水平筛选结果，最终选乙醇浓度80%～95%（X1）、溶剂用量4～10 倍（X2）、提取时间90～180min（X3）为考察因素水平。由于提取次数为非连续变量，在星点设计处理结果模型拟合中比较困难，再结合单因素考察结果，把提取次数定为2 次，分别测定二氢槲皮素质量分数，取其平均数作为响应值。优选提取工艺。CCD 效应面试验的因素水平见表4；CCD 效应面试验设计与结果见表5。

二氢槲皮素质量分数（%）=每1mL 落叶松中二氢槲皮素含量×稀释倍数/落叶松木药材取样量。

表4 CCD 效应面试验的因素水平Tab.4 Factor level of CCD effect surface test

表5 CCD 效应面试验设计与结果Tab.5 CCD effect surface test design and results

使用statistica 软件将表1 数据进行非线性拟合。以二氢槲皮素得率为因变量对各因素进行多元线性回归和二项式拟合，多元非线性回归：

Y =84.08 +0.25X1+0.13X2+0.11X3+0.12X1X2+0.24X2X3-0.20X1X3-0.31X12-0.12X22-0.13X32。经t检验显示，模型方程具有显著性（P＜0.05），r＝0.9866，表明该模型的拟合良好。对模型方程求极值得X1=81.21%，X2=8.21，X3=118.15min。

2.3 提取工艺参数优化

把因变量与另两因素拟合为三维曲面图，因只能表达含两个因素的函数，故固定3 个变量中的一个为中值，再以拟合的目标函数为数学模型，绘制因变量曲面图。

根据Design expert 8.0.6 软件分析结果，见图4，得到二氢槲皮素提取率较佳工艺范围：X1：60～90%，X2：4～10 倍，X3：90～180min。结果表明，根据Design expert 8.0.6 软件分析结果及模型方程极值点对应的条件，并综合考虑实际生产情况，选取二氢槲皮素提取工艺为：第一次10 倍量80%乙醇回流120min，第二次8 倍量80%乙醇回流90min，结果较为理想，二氢槲皮素提出含量较高，可说明此工艺条件具有良好的可行性。

3 结论

本实验用HPLC 法提取落叶松中的二氢槲皮素，实验结果为提取液乙醇浓度为80%、溶剂用量为药材的10 倍量、提取时间为120min、提取2 次时落叶松中二氢槲皮素含量较高，为163.0mg·mL-1。如若考虑到实际生产，乙醇回收问题，在考虑成本情况下，也可将第一次倍量调制10 倍量、提取时间120min，第二次提取量8 倍量、提取时间90min。