大麻素2型受体激动剂对脓毒症大鼠急性肾损伤的影响*

高翠敏，郭娜，宁海慧，邢博民，马玉清

（1.兰州大学第一临床医学院 麻醉学，甘肃 兰州730099；2.兰州大学第一医院 麻醉科，甘肃 兰州730099）

脓毒症是宿主对感染反应失调所导致的危及生命的多器官功能障碍[1]。急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）是脓毒症最严重、最常见的并发症[2]，其发生机制可能与炎症反应、肾近端小管上皮细胞损伤及肾脏局部微循环障碍有关[3-4]。大麻素2 型受体（CB2R）主要存在于免疫细胞上，参与免疫调节，发挥抗炎作用[5-6]。脓毒症时，CB2R 表达上调，调节炎症反应[7]。自噬是一种重要的细胞调节机制，通过主动消除细胞内微生物，促进抗原呈递，调节炎症反应和去除受损细胞器（如线粒体）来抵御微生物入侵，维持机体内环境稳定[8-9]。研究发现，激活CB2R 可以增强巨噬细胞的自噬作用，促进高迁移率族蛋白B1 的降解，减轻脓毒症炎症反应[10]。但激活CB2R 对脓毒症AKI是否有保护作用，以及其与自噬的关系，尚未见相关报道。本研究采取盲肠结扎穿孔法复制大鼠脓毒症模型，探讨CB2R 激动剂JWH133 对脓毒症大鼠AKI 的影响及与自噬表达的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

健康成年SD 雄性大鼠24 只[动物生产许可证号：SCXK（甘）2018-0002]，8 周龄，体重（200±20）g，购自兰州大学医学院动物实验中心。CB2R激动剂JWH133 购自美国APExBIO 公司，血清肌酐（Scr）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，兔抗鼠Beclin-1、兔抗鼠Atg-5 一抗购自美国ABclonal 生物技术有限公司，羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物科技有限公司。

1.2 动物分组及模型复制

将大鼠按照随机数字表法分为假手术组（Sham 组）、脓毒症组（Sep 组）及脓毒症+CB2R 激动剂JWH133 组（Sep+JWH133 组），每组8 只。参照文献[11]采取盲肠结扎穿孔法复制大鼠脓毒症模型。腹腔注射10%水合氯醛3～4 ml/kg 麻醉，腹部备皮、消毒，沿腹中线打开腹腔，切口约1～2 cm，探查腹腔并找到盲肠。Sham 组仅翻动盲肠后关腹。Sep 组和Sep+JWH133 组分别于盲肠1/2 处用3-0 无菌丝线结扎，并用18 G 无菌针头在结扎段盲肠处来回穿刺2 次，挤出少量肠腔内容物，保证穿刺点通畅后，将盲肠回纳并逐层关腹。Sep+JWH133 组于术后1 h 腹腔注射JWH133 1.5 mg/kg，Sham 组和Sep 组于上述时间点腹腔注射等量生理盐水。所有动物于术后立即进行液体复苏。

1.3 标本收集及检测

模型复制24 h 后心脏取血并对大鼠实行安乐死，取小肠组织及肾脏组织标本待测。

1.3.1 肾功能检测取血清，按照ELISA 试剂盒说明书，检测Scr 水平。

1.3.2 小肠组织及肾脏组织形态学观察分别将小肠组织及肾脏组织用10%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE 染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察组织病理变化。使用等级量表评估小肠的组织学损伤程度：0 级，正常组织学；1 级，表面上皮轻微破坏；2 级，绒毛尖端的上皮细胞丢失和损伤；3 级，黏膜血管阻塞、出血和局灶性坏死，绒毛损失少于一半；4 级，损害扩大到绒毛的一半以上[12]。使用Paller 法评估肾小管损伤程度，即200 倍高倍镜下，每个视野选取10 个肾小管进行评分，按5 个视野（50 个肾小管）计分，评分标准：肾小管明显扩张、细胞扁平计1分；肾小管内出现管型计2分；肾小管管腔内有脱落、坏死细胞，但未成管型或细胞碎片计1分；上皮细胞颗粒变性计1分；空泡变性计1分；细胞核固缩计1分[13]。

1.3.3 免疫组织化学法通过免疫组织化学法检测肾小管自噬相关蛋白Beclin-1、Atg5 的表达水平。取肾脏组织，10%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片。分别加入兔抗鼠Beclin-1 一抗（稀释度1∶100）、兔抗鼠Atg-5 一抗（稀释度1∶100），37℃孵育60 min；PBS 洗涤3 次，3 min/次，滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（稀释度1∶100），室温孵育30 min；DAB 显色，过蒸馏水，苏木精复染，脱水，树胶封片，光镜下观察肾脏组织并采用Image Pro Plus6.0 图像分析软件测定平均光密度值。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较用方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠小肠组织病理改变

Sham 组为正常小肠组织，无血管破坏，无炎症细胞浸润，小肠组织损伤程度为0 级；Sep 组可见小肠绒毛上皮组织缺失或连续性中断，黏膜血管出血，炎症细胞大量浸润，组织损伤程度≥3 级；Sep+JWH133 组小肠组织病变明显减轻，绒毛上皮组织较完整，仅有少许血管出血，少量炎症细胞浸润，组织损伤程度≤2 级。见图1。

图1 小肠组织病理切片 （HE染色×200）

2.2 各组大鼠肾组织病理学改变

Sham 组肾脏组织形态学正常，可见正常的肾小管管腔，肾小管上皮细胞排列规则；Sep 组肾脏正常形态被破坏，肾近端小管上皮细胞排列紊乱，肾小球体积明显增大，系膜细胞肿胀，间质有明显出血及大量炎症细胞浸润；Sep+JWH133 组肾脏结构较完整，间质仅有少量出血及炎症细胞浸润。见图2。

2.3 各组大鼠肾功能变化及肾小管损伤程度评分

各组大鼠Scr、肾小管Paller 评分比较，差异有统计学意义（P<0.05），Sep 组和Sep+JWH133 组较Sham 组升高（P<0.05），Sep+JWH133 组较Sep 组降低（P<0.05）。见表1。

图2 各组大鼠肾脏组织病理切片 （HE染色×200）

表1 各组大鼠Scr、Paller评分比较 （n=8，±s）

表1 各组大鼠Scr、Paller评分比较 （n=8，±s）

组别Scr/（μmol/L）Paller评分Sham组Sep组Sep+JWH133组F 值P 值87.15±4.86 108.86±8.46 97.67±4.34 24.809 0.000 2.87±0.75 40.38±1.93 28.50±2.12 1004.364 0.000

2.4 各组肾小管自噬相关蛋白表达水平比较

各组肾小管自噬相关蛋白Beclin-1、Atg5 的表达水平比较，差异有统计学意义（P<0.05），Sep组 和Sep+JWH133 组较Sham 组上调（P<0.05），Sep+JWH133 组较Sep 组上调（P<0.05）。见表2 和图3、4。

表2 各组大鼠肾脏自噬相关蛋白Beclin-1、Atg5表达水平比较 （n=8，±s）

表2 各组大鼠肾脏自噬相关蛋白Beclin-1、Atg5表达水平比较 （n=8，±s）

组别Beclin-1 Atg5 Sham组Sep组Sep+JWH133组F 值P 值9.95±1.59 16.26±1.77 24.97±2.68 106.290 0.000 4.38±0.56 7.59±0.69 12.79±1.14 206.906 0.000

图3 各组大鼠肾脏组织自噬相关蛋白Beclin-1的表达 （免疫组织化学染色×200）

图4 各组大鼠肾脏组织自噬相关蛋白Atg5的表达 （免疫组织化学染色×200）

3 讨论

本研究显示Sep 组大鼠出现寒战、畏缩、拒食；Scr 明显升高；光镜下小肠绒毛上皮组织缺失或连续性中断，黏膜血管出血，炎症细胞大量浸润，肾近端小管上皮细胞排列紊乱，肾小球体积明显增大，系膜细胞肿胀，间质有明显出血及大量炎症细胞浸润，提示脓毒症大鼠AKI 模型复制成功。

CB2R 属于内源性大麻素系统，主要存在于小胶质细胞及外周免疫细胞上，是机体内重要的炎症调节因子，通过抑制中性粒细胞粘附聚集，减轻炎症反应[14]。相关文献报道，当机体发生组织损伤或者炎症反应时，CB2R 表达可增加至基础水平的100 倍以上[15]。本研究参照文献[16]选择CB2R 激动剂JWH133 1.5 mg/kg 进行干预，结果发现：与Sep 组相比，Sep+JWH133 组大鼠Scr、肾小管Paller评分降低，肾脏结构较完整，肾脏病理损伤轻微，肾间质仅有少量出血及炎症细胞浸润。提示CB2R激动剂可以调节肾脏炎症反应，减轻脓毒症大鼠AKI。推测其机制可能与JWH133 激动剂上调CB2R的表达有关。作为潜在的抗炎药物，CB2R 激动剂已被证实在治疗眼部炎症性疾病方面有重要作用[17-18]。但CB2R 激动剂是否通过增强自噬的表达来发挥对脓毒症AKI 的保护作用，目前尚未完全明确。

肾近端小管上皮细胞损伤是AKI 的主要发生机制之一，MEI 等[19]发现，自噬能够拮抗细胞凋亡，对LPS 介导的肾小管上皮细胞损伤有保护作用。脓毒症早期，革兰阴性菌的脂多糖与Toll 样受体4 结合，通过MAPK/p38 信号转导轴激活了自噬，而脂磷壁酸与Toll 样受体2 的结合则诱导了自噬，并通过促进自噬体的形成使自噬表达增强[8]。自噬相关蛋白Beclin-1 参与早期自噬，促进自噬小泡的成核和从细胞溶质招募蛋白质，是自噬体形成的标志[20]。自噬相关蛋白Atg5 是参与自噬过程的特异性蛋白，同时也是LC3 脂质化必不可少的因子，而LC3 脂质化是自噬诱导的标志[20]。本研究观察到，Sep 组大鼠肾脏组织自噬相关蛋白Beclin-1 和Atg5的表达水平有所上调，表明脓毒症AKI 时自噬被诱导，与MEI 等[19]报道的自噬可能通过拮抗脓毒症介导的肾近端小管上皮细胞凋亡，从而发挥对肾组织的保护作用结果一致。使用CB2R 激动剂JWH133 后，脓毒症大鼠肾脏组织自噬相关蛋白Beclin-1 和Atg5 的表达水平进一步上调，同时肾脏病理损伤减轻，Scr 及肾小管损伤评分下降，说明CB2R 激动剂可能通过增强脓毒症大鼠肾脏的自噬表达水平，拮抗肾小管上皮细胞损伤，从而发挥肾脏保护作用。

综上所述，激活CB2R 能够减轻脓毒症大鼠AKI，其作用机制可能与诱导和促进脓毒症大鼠肾近端小管上皮细胞自噬，减轻炎症反应，拮抗肾近端小管上皮细胞损伤有关。这一发现或为脓毒症AKI 的治疗提供新的方向。