氧化型低密度脂蛋白和核因子-κB在颈动脉粥样硬化中的应用*

刘首明，江小萍，沈祖泓，刘冰冰，朱少琴，柳 健

广东省清远市中医院：1.检验科；2.老干部保健科；3.科教部；4.功能科,广东清远 511500

我国因动脉粥样硬化(AS)引起的急性心脑血管疾病形势越来越严峻，颈动脉内膜中层厚度(CIMT)增加和形成斑块的不稳定性是心脑血管疾病发病的重要生理、病理基础[1]。大量研究证实,AS是多种免疫因素和炎症因子参与的慢性炎性疾病[2-3]；AS以机体内皮细胞受损、功能障碍为起始，继而血脂侵入内皮组织下，引起单核细胞、巨噬细胞浸润及平滑肌细胞迁移至内膜下增殖并吞噬脂质形成泡沫细胞，分泌多种促炎细胞因子，导致动脉内膜增厚、纤维化和粥样斑块形成。有文献报道，AS发病机制涉及炎性反应、脂质代谢失调及氧化应激等多种病理生理机制[4]。因此，从AS炎症信号通路角度研究干预AS病变过程具有重要意义。低密度脂蛋白(LDL)是导致AS的主要危险因素，可引起血管壁损伤、血管内皮通透性增强并大量释放氧自由基[5]，可氧化循环中的LDL修饰成为氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)，并聚集于内皮细胞下，具有强烈的致AS作用，并成为AS研究的热点之一。核因子-κB(NF-κB)是一种具有多项基因转录调控作用的转录因子，存在于心肌细胞、血管平滑肌细胞及内皮细胞中，参与多种心血管疾病的发生和发展。本研究旨在证实oxLDL水平和AS NF-κB p65表达水平在中西结合用药的情况下对颈动脉粥样硬化及斑块的影响及相关性，为临床治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年1月至2018年12月本院心血管科收治的符合AS诊断标准的111例患者作为研究对象，其中男65例，女46例，平均年龄(66.50±14.24)岁。所有入选者均知情同意并签署知情同意书，本研究经本院医学伦理委员会批准。纳入标准：符合《中国成人血脂异常防治指南》[6]的诊断标准，血脂异常、CIMT≥ 0.9 mm或(和)有颈动脉粥样硬化斑块的患者；排除标准，已知或在随访期间患严重肝肾疾病、肿瘤、恶病质等患者。将111例患者随机分成氟伐他汀组37例，男21例，女16例，平均年龄(65.86±13.86)岁；三七总皂苷组36例，男21例，女15例，平均年龄(66.28±12.59)岁；中西医结合组38例，男23例，女15例，平均年龄(67.32±12.29)岁。根据是否有斑块形成，又将患者分为非斑块组66例，男37例，女29例，平均年龄(65.73±14.24)岁;斑块组45例，男28例，女17例，平均年龄(67.02±12.33)岁。3组患者性别、年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2治疗方法 入选患者均进行常规治疗，AS治疗方法分为氟伐他汀组口服氟伐他汀钠40 mg，1次/天；三七总皂苷组口服三七总皂苷(血塞通)100 mg，3次/天；中西医结合组同时口服以上两种药物，用法与前两组一致。治疗周期均为12周。三七总皂苷(血塞通)批号：国药准字 Z20040016，氟伐他汀钠批号：国药准字H20010518[7]。停用氟伐他汀警戒值[6]：服药期间出现肌肉疼痛症状，且血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)或天门冬氨酸氨基转移酶(AST)达到正常高限3倍及合并总胆红素升高、肌酸激酶(CK)达到正常高限5 倍、肌酐为221 mmoL/L等严重不良反应，应减少用药剂量或停药。

1.3血清标本收集及检测 患者入组后记录其年龄、性别、体质量、病史情况等，采集标本前72 h禁止饮酒及高脂饮食。入院后于用药前和用药治疗12周后分别采集空腹静脉血5～10 mL[7]，以3 000 r/min离心10 min 分离血清。血清oxLDL水平检测采用双抗体夹心 ELISA，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，所有检测均严格按照仪器及试剂盒说明书进行。

1.4外周血单个核细胞(PBMC)提取 取抗凝血约 6 mL，加入等体积磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，再加6 mL淋巴分离液；血样、PBS、分离液体积比为1∶1∶1。3 000 r/min离心25 min，吸出血浆层与分离液层之间的白色膜状物；并加入相同体积的PBS，混匀，1 500 r/min离心10 min；重复洗涤3次，即为提取的PBMC[8]。

1.5NF-κB p65表达测定 采用免疫组织化学法对NF-κB进行检测：对分离出的PBMC利用4%多聚甲醛进行固定，选择鼠抗人NF-κB p65单克隆抗体，稀释比例1∶200，利用瑞氏染色法检测活细胞比例[8]。采用Olympus显微镜(400倍)进行观察并采集图像，按染色结果判定阳性细胞百分率为NF-κB p65的表达水平。NF-κB p65抗体试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，所有检测均严格按照标准操作规程进行。

1.6颈动脉超声检查 采用美国通用GEV7超声诊断仪进行颈动脉超声检查，周围血管探头频率为7.5～10.0 MHz，于治疗前后分别测量左右两侧颈总动脉，颈内、颈外动脉和颈动脉分叉处 CIMT及斑块[9-10]。CIMT<0.9 mm 为内膜中层厚度正常，0.9 mm≤CIMT<1.2 mm 为内膜中层增厚，以内膜局限性突出管腔、内膜厚度≥1.2 mm 为斑块形成。

1.7观察用药后反应 观察肝肾功能、胃肠道反应、出血情况及其他不良反应。

2 结 果

2.13组患者用药前后CIMT、oxLDL和 NF-κB p65水平比较 用药前3组患者CIMT、oxLDL、NF-κB p65水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；用药12周后与用药前比较，3组患者CIMT、oxLDL、NF-κB p65水平均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；用药12周后，中西医结合组患者与氟伐他汀组、三七总皂苷组比较，oxLDL、NF-κB p65水平均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组患者用药前后CIMT、oxLDL和 NF-κB p65水平比较

2.2斑块组与非斑块组患者CIMT、oxLDL和 NF-κB p65水平比较 用药前和用药12周后,斑块组患者CIMT、oxLDL和NF-κB p65水平均明显高于非斑块组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 斑块组与非斑块组患者CIMT、oxLDL和 NF-κB p65水平比较

2.3血清oxLDL水平与CIMT的相关性分析 血清oxLDL水平、PBMC中NF-κB p65水平与CIMT增厚及斑块性质均呈明显正相关(r=0.599、0.410，P<0.05)；且血清oxLDL水平与PBMC中NF-κB p65水平呈明显正相关(r=0.636，P<0.05)。

2.43组患者用药后不良反应发生率比较 氟伐他汀组、三七总皂苷组、中西医结合组患者用药过程中肝肾功能、胃肠道反应、出血情况及其他不良反应发生率分别为2.70%、2.77%、2.63%，差异均无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

有研究认为，AS是一个复杂的病理过程，实质是细胞介导的多种因素共同参与的慢性炎性反应，与重要脏器损害存在关联，并且决定动脉粥样硬化斑块的稳定性[11]。在整个疾病发展的过程中内皮功能受损是最早期改变，由于血管内皮细胞的损伤或功能失调，导致血管活性物质分泌与释放紊乱，造成血管内皮细胞抗血栓能力降低，并表达大量的细胞黏附因子，促进血管内炎性反应发生，导致粥样斑块与血栓形成。因此，血管内皮功能评价已经作为一种重要的诊断和研究方法应用于临床[12]。

oxLDL导致血管内皮细胞损伤和功能障碍，细胞内大量胆固醇汇集，进而形成单核巨噬细胞源性泡沫细胞，大量泡沫细胞停留在血管壁内，导致炎性反应发生，使动脉粥样硬化斑块得以形成，从而累及AS的各个阶段，亦影响不稳定及易损斑块发生、演变及破裂。oxLDL作为AS的独立危险因素，是参与心血管疾病风险评估的重要循环生物标志物。降低循环中oxLDL水平，是抗AS及预防其并发症的一条途径[13]。

NF-κB是一种重要的核内转录因子，广泛参与炎症介质、黏附分子和趋化因子、单核细胞趋化蛋白和基质金属蛋白酶等基因的调控，在机体非特异性免疫反应中发挥重要作用。NF-κB抑制蛋白通过调控NF-κB 信号通路的活动，参与内皮细胞的活化和炎症因子的表达，在AS的形成、发展过程中影响极深。许多NF-κB 诱导物和受调解的基因直接或间接涉及AS，发挥抗AS作用，因此，发现特异性的NF-κB 通路抑制剂可能是抗AS、抗炎和抗细胞凋亡的新治疗途径[14]。

ox-LDL对NF-κB信号通路的影响及作用机制目前尚无定论。有文献报道,ox-LDL可激活NF-κB信号通路，从而使p65/p50从细胞质进入细胞核内，同时发现核蛋白中p65/p50的表达随ox-LDL诱导水平增高和诱导时间的延长而增高，由此证明ox-LDL激活NF-κB信号通路存在浓度和时间效应关系。ox-LDL和NF-κB相互作用在AS斑块的形成、发展及破裂过程中发挥至关重要的作用。

本研究以AS患者血清ox-LDL水平和PBMC中NF-κB p65水平在氟伐他汀和三七总皂苷治疗前后的变化来证实其对颈动脉粥样硬化的影响，为临床研究提供新的思路和方法。结果显示，不论是单独用药还是中西医结合治疗AS，与用药前比较，各组患者oxLDL、NF-κB p65水平均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；中西医结合组治疗后oxLDL、NF-κB p65水平与其他两组比较均明显降低，说明氟伐他汀和三七总皂苷均可有效降低oxLDL、NF-κB p65的表达。氟伐他汀和三七总皂苷均具有抗血栓、降血脂、抑制血小板聚集、减轻炎性反应、保护血管内皮的功能，以及抑制颈动脉内膜增厚及动脉粥样硬化斑块形成。本研究证实，血清oxLDL水平、PBMC中NF-κB p65水平与CIMT增厚及斑块性质呈明显正相关，均参与了AS疾病的发生和发展过程，可作为评估动脉粥样硬化斑块形成情况有价值的实验室指标。

综上所述 ，血清ox-LDL可激活NF-κB 信号通路，并且ox-LDL水平越高，其激活NF-κB 信号通路的能力越强，对其干预治疗AS作用机制的研究，为中医药治疗AS提供了更多思路。血清ox-LDL及PBMC中NF-κB p65水平有助于早期诊断和预防AS， 对其严重程度及其预后也能进行评估。