miR-542-3p对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及机制探讨

周显飞，张阳，兰勇，聂寒秋，邢人伟，牟永华

（台州学院附属台州市立医院 肝胆外科，浙江 台州 318000）

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是常见的恶性肿瘤之一，病死率仍高居癌症第二位，在我国每年肝癌新增病例数占到全球的二分之一[1]。目前在肝癌的早期诊断、手术切除治疗、介入治疗以及靶向化疗等方面取得了较大进展，但肝癌患者的整体生存率并没有得到明显的提高[2]。因此，寻找肝癌早期诊断及治疗的标志物十分重要。HCC的发生发展与多种癌基因过度表达以及肿瘤抑制基因失活密切相关[3]。研究表明miRNA在肝癌中起到重要的作用[4]，miR-542-3p是近来新发现的具有肿瘤抑制功能的microRNA，在肺癌、乳腺癌、食管癌、结直肠癌等中呈低表达，具有抑制肿瘤生物恶性生物学行为的特点[5-8]。有研究表明miR-542-3p在肝癌细胞中低表达，而且当下调miR-542-3p后肝癌细胞侵袭转移的能力增强[9]。本实验首先通过RT-PCR检测miR-542-3p在肝癌细胞及组织中表达情况，再通过体外转染miR-542-3p模拟物后，通过体外实验验证miR-542-3p对肝癌细胞恶性生物学特性的影响，并探讨其侵袭转移的可能机制。

1 材料和方法

1.1 组织标本收集及细胞培养

收集台州市立医院2014—2018 年收治的40 例肝癌患者病例资料，所有病例经病理诊断证实为原发性肝癌，且术前均未做任何治疗。人肝癌细胞系HCCLM3、Hep3B、Huh7、SMMC-7721、MHCC-97H、MHCC-97L以及人正常肝细胞LO2均取自台州学院医学院中心实验室。细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640和DMEM培养基培养；于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。视细胞生长情况，更换培养基。

1.2 miR-542-3p在肝癌组织及肝癌细胞中的表达量检测

实时荧光定量PCR：用Trizol试剂盒，根据操作说明提取组织标本及各细胞系细胞的总RNA，测定总RNA浓度，根据TaKaRa公司说明书严格进行逆转录及实时定量聚合酶链（RT-PCR）反应，每组3个复孔，以U6作为内参，在伯乐（Bio-Rad）实时定量PCR仪器进行检测，miR-542-3p的上游引物序列为5’-GGCGGTGTGACAGATTGATAA-3’，下游引物序列5’-TCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCG CACTGGATACGACTTTCAG-3’；U6的上游引物序列为5’-TTATGGGTCCTAGCCTGAC-3’，下游引物序列5’-CACTATTGCGGGCTGC-3’，RT-PCR反应条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。miR-542-3p的相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.3 转染miR-542-3p类似物（mimics）及阴性对照（NC）

miR-542-3p mimics及miR-542-3p NC由广州锐博生物科技有限公司合成提供。选取miR-542-3p表达最低的两株肝癌细胞MHCC-97H和HCCLM3，按照LiopfectamineTM3000试剂说明书操作，分别将miR-542-3p mimics（miR-542-3p过表达组）及miR-542-3p NC（阴性对照组）转染入MHCC-97H和HCCLM3中，均设置3个复孔。采用RT-PCR法验证转染48 h后转染效率。

1.4 对肝癌细胞增殖的检测

采用CCK-8法：将转染48 h的MHCC-97H和HCCLM3 细胞常规消化，PBS洗细胞两遍，培养基重悬细胞，调整细胞密度，以3×103个每孔细胞接种于96孔板中，设置3个复孔，每组分别设24 h、48 h及72 h检测时间点；检测前每孔分别加入CCK-8 试剂10 μL，避光37 ℃孵育2 h，轻轻振荡，保证每孔无气泡，放置于酶标仪上，450 nm波长处测定光密度（OD）值，观察miR-542-3p对肝癌细胞增殖的影响。

1.5 肝癌细胞侵袭及转移的检测

Transwell小室侵袭及转移实验：将转染48 h的MHCC-97H和HCCLM3细胞常规消化，PBS洗细胞两遍，用无血清的培养基制成单细胞悬液，按1×108/mL的细胞密度，分别加200 μL细胞悬液至无matrigel胶和已经铺好matrigel胶Transwell上室中，下室加入含12%血清的培养液700 μL，每个转染后的细胞均设置3 个复孔，常规37 ℃孵育24 h，取出上室，棉球拭去上室未侵袭的细胞，4%多聚甲醛固定20 min后，1%结晶紫染色20 min，PBS清洗干净后进行风干。显微镜观察细胞的侵袭转移情况，随机选取3个视野，拍照计数。

1.6 肝癌细胞上皮间质转化（EMT）的检测

Western blotting实验：取转染48 h的MHCC-97H和HCCLM3细胞，用RIPA蛋白裂解液裂解细胞，取2 μL蛋白样品用于BCA法测蛋白浓度，按50 μg上样量计算得出上样体积；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行实验；敷孵育一抗β-Actin（1:5 000），E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Snail1（均为1:1 000）4 ℃摇床过夜；室温敷育二抗2 h后用ECL化学发光试剂曝光，用ImageJ 1.42软件进行灰度分析。

免疫荧光实验：取转染48 h的MHCC-97H和HCCLM3细胞，进行细胞爬片，于37 ℃二氧化碳培养箱中培养24 h后进行细胞固定，0.1% Triton X-100细胞透化处理，M-缓冲液洗涤细胞3 次，去除非特异蛋白，1% BSA（牛血清白蛋白，PBS新鲜配制）封闭液细胞封闭1 h，移去封闭液，在爬片上滴加大约20 μL稀释好的一抗，4 ℃冰箱中过夜进行一抗染色，对应一抗的的种属在相应的爬片上滴加大约20 μL稀释好的二抗，置于湿盒中，在37 ℃培养箱中温育反应2 h进行二抗染色，滴加大约10 μL的DAPI于玻片上进行细胞核染色，室温孵育10 min，PBS洗涤细胞两次，每次5 min。最后将染色处理完毕的玻片盖在封片剂上，置暗盒里待其风干。取制备好的玻片于共聚焦激光显微镜下观察并拍照。

1.7 统计学分析

采用SPSS 22.0对实验数据进行处理与分析，所得结果用（±s）表示。两组之间比较采用配对t检验；多组之间比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-542-3p在肝癌组织及肝癌细胞系中的表达

miR-542-3p在肝癌组织（n=40）和癌旁组织（n=40）的表达量[（0.208±0.064）vs（0.746±0.093）]有统计学差异，肝癌组织表达明显低于其癌旁组织（P＜0.05，图1A）。miR-542-3p在人肝癌细胞系SMMC-7721、HCCLM3、MHCC-97L、Huh7、Hep3B、MHCC-97H表达量分别为（0.688±0.049）、（0.221±0.034）、（0.473±0.041）、（0.561±0.029）、（0.764±0.059）、（0.162±0.031），均显著低于其在人正常肝细胞LO2中的表达量，差异具有统计学意义（P＜0.05，图1B）。

图1 miR-542-3p在肝癌组织中的表达水平（A）及肝癌细胞系中的表达水平（B）

2.2 转染miR-542-3p mimics效果

RT-PCR检测结果显示，miR-542-3p在转染miR-542-3p mimics与阴性对照HCCLM3[（1.054±0.156）vs（0.510±0.059）]和MHCC-97H[（1.193±0.244）vs（0.323±0.081）]中的表达量具有统计学差异（图2），这提示过表达miR-542-3p在HCCLM3 和MHCC-97H细胞中转染有效。

2.3 miR-542-3p对肝癌细胞增殖的影响

CCK-8 法检测结果表明，miR-542-3p过表达HCCLM3和MHCC-97H细胞的吸光度值低于阴性对照，差异具有统计学意义（P＜0.05，图3）；这提示上调miR-542-3p在肝癌细胞系中的表达可显著抑制肝癌细胞的增殖能力，且转染时间越长，抑制效果越明显。

2.4 miR-542-3p对肝癌细胞侵袭及转移能力的影响

图2 miR-542-3p过表达后在HCCLM3和MHCC-97H细胞系中的表达水平

Transwell小室侵袭转移实验，结果显示：miR-542-3p过表达组细胞穿过小室的细胞数量明显少于阴性对照组（图4）。这提示，miR-542-3p过表达可显著抑制肝癌细胞的侵袭及转移能力。

2.5 miR-542-3p对肝癌细胞上皮间质转化（EMT）的影响

Western blotting实验结果显示，在肝癌细胞系HCCLM3和MHCC-97H中，miR-542-3p过表达组Ecadherin蛋白的表达增加，Vimentin、N-cadherin和Snail1 蛋白的表达减少（图5A、B）。此结果说明过表达miR-542-3p具有抑制肝癌细胞EMT的作用。为进一步证实miR-542-3p对HCC细胞EMT的影响，我们应用免疫荧光检测过表达miR-542-3p后HCC细胞形态的变化以及EMT相关蛋白的表达变化。结果检测显示，过表达miR-542-3p后，上皮标志蛋白E-cadherin的红色荧光强度增高，而间质标志蛋白Vimentin、N-cadherin和Snail1的红色荧光强度降低（图5C），这表明过表达miR-542-3p后抑制HCC细胞EMT。

3 讨论

图3 miR-542-3p过表达组及阴性对照组在HCCLM3和MHCC-97H细胞系中的细胞增殖情况

图4 过表达miR-542-3p对HCCLM3和MHCC-97H细胞侵袭转移的影响（结晶紫染色，×200）

图5 过表达miRNA-542-3p对EMT相关蛋白的影响

近年来肝癌发病率和病死率呈总体上升趋势，在我国每年约有38万人死于肝癌，占全球肝癌死亡病例数的51%[10]。由于肝癌临床症状隐匿，且其具有生长速度快、恶性程度高、易复发转移等特点，预后较差[11]，因此临床上亟需探索新的肝癌生物标志物和新的治疗策略。miRNAs已被证实在肝癌的发生发展中具有重要作用。临床研究表明，miRNA在肝癌中表达谱变化较大，可用异常表达的miRNA来辅助诊断肝癌[12]；此外Sato等[13]发现异常表达的miRNA谱可用于预测肝癌术后的复发情况。

miRNA-542-3p为新发现的肿瘤抑制因子，已经被证实在多种恶性肿瘤中呈低表达，如肺癌、乳腺癌、食管癌、结直肠癌[5-8]。Zhang等[9]研究发现miRNA-542-3p在肝癌中呈低表达，起到抑癌基因的作用。同样，在本研究中我们发现在肝癌组织及细胞系中miR-542-3p明显下调。

多项研究显示，miR-542-3p可以通过作用于靶基因如生存素[14]、PIM1[15]、p53[16]以及AKT信号通路[17]等共同调节肿瘤细胞的增殖、凋亡、细胞周期等多种生理活动从而调控肿瘤的发生发展进程。Wang等[18]研究发现过表达miR-542-3p能下调存活素，抑制HCC细胞增殖及裸鼠体内HCC瘤体生长。在本研究中，我们通过CCK-8实验证实miR-542-3p具有抑制肝癌细胞增殖能力，提示miR-542-3p参与肝癌的发生发展。

局部和全身转移是导致肝癌预后不理想的关键因素。越来越多的研究证实，miRNA是癌症转移的关键调节剂，包括肝癌[19]。Takeyama等[20]通过miRNA基因芯片及qRT-PCR分析研究发现，与不伴有肝转移的结直肠癌相比，伴有肝转移的结直肠癌组织中miR-542-3p的表达水平明显较低，说明miR-542-3p对结直肠癌的肝转移有抑制作用。在本研究中，Transwell实验表明miR-542-3p具有抑制肝癌细胞侵袭和转移的能力。

上皮间质转化（EMT）在肿瘤侵袭和转移中起着重要作用[21]。在肿瘤EMT过程中，上皮标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）、紧密连接蛋白ZO-1（zonula occluden-l）等表达下调，间质标志物波形蛋白（Vimentin）、N型钙黏蛋白（N-cadherin）等表达上调，表现为上皮源性的肿瘤细胞失去细胞极性，细胞间的连接变得疏松，胞内骨架蛋白发生重组。这一系列的改变导致肿瘤细胞的黏附能力下降，迁移运动能力增加，使得肿瘤细胞更易于离开原有位置，发生原位浸润或者随血行、淋巴等途径转移到体内远隔部位，重新定位于新的器官或组织，最终导致肿瘤患者死亡。EMT是肝癌转移的关键过程[22]，本研究中Western boltting和免疫荧光实验结果均提示，当miR-542-3p过表达时，上皮标志物E-cadherin蛋白表达增加，而间质标志物Vimentin、N-cadherin、Snail1蛋白表达减少，证明了miR-542-3p具有抑制肝癌细胞EMT的作用，结果提示miR-542-3p通过抑制EMT表型抑制肝癌侵袭转移。

综上所述，miR-542-3p可以抑制肝癌细胞的恶性生物学行为，在肝癌的发生、发展、侵袭转移等过程中发挥重要作用，且与EMT通路有关。但其作用的下游靶基因尚不完全清楚，本课题组接下来将通过重点研究miR-542-3p可能的靶基因，进一步阐明miR-542-3p在肝癌发生、发展中的分子机制及其重要性。