苗药定痛汤治疗偏头痛网络药理学研究

黄 湲，吴远华，蔡 静，张东兰，丁 维，刘时喜，董红彦

(1.贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳 550001；2.河北中医学院,河北 石家庄 050200)

网络药理学是将药理学和生物信息学结合，构建“疾病-基因-靶点-药物”网络模型分析阐述药物对疾病网络作用机制。中药复方具有多成分、多靶点、多途径的特点，可通过网络药理学整体性、系统性的研究方法，从生物分子层面多角度地对其作用机制进行探讨。

苗药定痛汤由大血藤(那嘎青)、川芎(锐猛摆)、白芷(加丢呦)、苕叶细辛(龚税苕)、炙甘草、全蝎、蜈蚣(岗叩)7味药组成，是我科邵勇主任基于苗医理论创立的治疗偏头痛的方剂，临床应用多年、疗效确切。前期研究发现该方具有抑炎、抗氧化功效，但是对于苗药定痛汤主要的活性成分及其作用机制仍不明确。因此，本研究从网络药理学角度，对苗药定痛汤治疗偏头痛的药效物质基础和作用机制进行探索及研究，以期为后续研究和临床应用提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 苗药定痛汤活性成分收集 分别以大血藤、川芎、白芷、苕叶细辛、炙甘草、全蝎、蜈蚣为检索词，从中药系统药理数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis，TCMSP)对上述药物所有成分数据库进行筛选和构建。筛选条件：OB (%)≥30，DL≥0.18；搜索TCMIP数据库获得并整合药物潜在活性成分和相应靶标信息，获得苗药定痛汤活性成分-靶点数据。

1.2 偏头痛相关靶点 利用疾病在线数据库TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、OMIM(https://omim.org/)、Genecards(https://www.genecards.org/)，以关键词“migraine”进行检索，获取偏头痛相关的基因。将TCMSP和以上3个疾病数据库中所检索到的靶点名与Uniprot在线资源数据库(https://www.uniprot.org/)进行联合，采用R语言检索分析，矫正靶点名称，获取优选匹配度高者的相应的基因。将矫正后苗药定痛汤和偏头痛基因进行整合，选取交集基因，即苗药定痛汤潜在的治疗靶点。

1.3 可视化药材-活性成分-疾病-靶点网络 将得到的苗药定痛汤活性成分-作用靶点-偏头痛治疗靶点整合，导入Cytoscape_v3.8.0 中对干预网络可视化，并且应用Analyzer工具对网络进行分析。

1.4 蛋白互作网络的构建 利用在线数据库STRING(https://string-db.org/)，以人为物种限定，筛选条件：相互作用阈值>0.9，导入苗药定痛汤治疗偏头痛的交集基因，建立“苗药定痛汤-migraine”靶标间的蛋白相互作用网络(PPI)，保存PPI网络数据tsv文件并将其导入Cytoscape_v3.8.0 中，运用Analyzer工具进行优化。

1.5 基因富集分析 运用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对潜在靶点进行GO功能分析。以P≤0.01为限定条件，运用Cytoscape_v3.8.0软件中ClueGO插件进行KEGG通路富集分析，从基因生物功能和信号通路的角度进一步明确苗药定痛汤对偏头痛的作用机制，并为后续药理学验证提供参考。

2 结 果

2.1 苗药定痛汤组方活性成分筛选 通过TCMSP检索苗药定痛汤5味药物(大血藤、白芷、细辛、川芎、甘草)所有化学成分，大血藤5个，白芷22个，川芎7个，细辛8个，甘草92个。根据限定阈值OB≥30%、 DL≥0.18进行筛选，剔除重复后共得到107个活性成分，大血藤3个，白芷13个，川芎3个，甘草88个。

2.2 苗药定痛汤治疗偏头痛直接作用靶点的筛选 将筛选的苗药定痛汤活性成分作用靶点和3个数据库中得到的2712个偏头痛靶点进行交集分析，选取交集基因共69个，即表示为直接作用于偏头痛的靶点。

2.3 苗药定痛汤活性成分-靶点相互作用网络 整合苗药定痛汤药材、活性成分、疾病靶点，于Cytoscape_v3.8.0 中构建相互作用网络，共有176个节点，其中活性成分节点107个，靶点节点69个，绿色节点表示药物活性成分，红色节点代表药物作用靶点。利用Cytoscape_v3.8.0中Network Analyzer插件计算网络度值，根据Degree值排名最高的前五位中，以槲皮素(Quercetin)具有最多的潜在靶标，其次是柚皮素(Naringenin)，山奈酚(Kaempferol)，异鼠李素(Isorhamnetin)，β-谷甾醇(Beta-sitosterol)，度值较高的药物活性成分可能是苗药定痛汤干预偏头痛的活性组分，提示苗药定痛汤多成分、多靶点的作用特点(图1)。

图1 苗药定痛汤活性成分-靶点相互作用网络

2.4 构建和分析苗药定痛汤与偏头痛的PPI 为进一步探索定痛汤干预偏头痛的潜在药理机制，将69个定痛汤作用靶点和偏头痛疾病相关靶点的交集基因导入在线数据库STRING中分析，以阈值>0.9为筛选条件，隐藏游离基因，得到一张包含56个节点，118条边的PPI图及相应tsv文件。将得到的文件导入Cytoscape_v3.8.0 中对PPI网络进行优化，结果显示，其中SIRT1与FOXO3、NFKB、IL-6均存在相关性。统计显示关联度最高的前30个靶点(EGFR、RELA、ESR1、FOS、CCND1、IL6、NR3C1、MYC、CASP8、NOS3、PRKCA、SIRT1、APOB、AR、VEGFA、CYP1A1、ERBB2、GSK3B、IKBKB、CHRM2、FOXO3、HIF1A、ICAM1、IRF1、NFKBIA、PGR、RASA1、BCL2、CAV1、ESR2)。

2.5 GO功能富集分析 运用DAVID数据库中对差异基因进行功能富集，分别富集到生物学过程582个条目、分子功能60个条目，细胞组分64个条目。以FDR值为依据，分别筛选整合富集度排名前20条目进行分析。以1～10个为组1，11～20个为组2，运用在线工具imageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/GOenrichmentplot.html)对结果进行可视化，其中X轴表示富集因子，Y轴为富集到的GO条目，气泡颜色表示FDR值显著性，颜色越红值越小，气泡大小表示富集在该条目中的差异基因数目。

生物学过程主要涉及有机物反应、细胞凋亡调控，细胞增殖调节、类固醇激素刺激、防御反应、内源性刺激反应、对抗应激反应、分子功能的正调控、细胞因子刺激反应等(图2)。分子功能主要涉及类固醇结合、酶结合、蛋白二聚化、特定DNA序列结合、雌激素受体活性、NF-κB结合、神经递质结合、表皮生长因子受体活性、蛋白质复合物结合、乙酰胆碱结合等(图3)；细胞组分主要涉及细胞分子、内膜系统、细胞外空间等 (图4)。

图2 GO功能分析(BP)气泡图

图3 GO功能分析(MF)气泡图

图4 GO功能分析(CC)气泡图

2.6 KEGG通路富集分析 利用Cytoscape_v3.8.0软件中的ClueGO插件对苗药定痛汤干预偏头痛差异基因进行功能富集，以P<0.01为阈值，共富集到73条通路，其中相互作用关系有316个通路。选取P值最小的20个通路，运用imageGP对结果进行可视化(图5)，其中X轴表示富集因子，Y轴为富集到的通路，气泡颜色表示P值显著性，颜色越红值越小，气泡大小表示富集在该通路中的差异基因数目。提示可能通过干预这些信号通路起到治疗偏头痛的作用。

3 讨 论

本研究以筛选苗药定痛汤潜在药效成分为切入点，构建“苗药定痛汤-作用靶点-偏头痛治疗靶点”网络图，共获得69个苗药定痛汤治疗偏头痛的潜在药物靶点，73条枢纽信号通路，不仅显示出苗药定痛汤多成分、多靶点的作用特征，还反映出该方对偏头痛多途径的药理作用。

苗药定痛汤中大血藤入血分，养血活血、祛风止痛，辅以辛香之川芎、白芷、全蝎、蜈蚣、细辛助脉气通行，甘草缓急止痛，共奏通气散血止痛之功，可用于治疗瘀血阻络型偏头痛。本研究构建的多维网络中，其中槲皮素有最多的相互作用关系。研究表明，槲皮素可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，抑制双转基因小鼠海马组织中Toll样受体4和NF-κB p65蛋白表达及肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis factor，TNF-a)、IL-1β、IL-6、环氧合酶2(Cyclooxygenase 2,COX2)、诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)mRNA表达，从而改善小鼠学习记忆能力和炎症损伤[1]。槲皮素还能通过激活PI3K/Akt通路并抑制ERK1/2信号通路从而减弱神经元细胞的自噬和凋亡，达到改善神经功能缺损和认知功能的作用[2]。柚皮素具有显著的抗炎、抗氧化作用[3]。在体外糖氧剥夺(OGD)离体脑缺血模型和大脑中动脉栓塞(MCAO)模型中，柚皮素干预后核因子E2相关因2(Nuclear factor erythroid-2 related factor 2，NRF2)基因的表达及抗氧化酶(SOD、NQO1)等水平上调，阻止线粒体去极化，凋亡相关蛋白(Caspase3/9)及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)水平下降，具有保护线粒体功能，能有效对抗缺血缺氧病理过程中神经元的氧化应激损伤[4]。柚皮素可能通过激活PI3K/Akt/SIRT1信号通路有关，对心脏骤停-心肺复苏大鼠心功能具有良好保护作用[5]。异鼠李素可通过激活Sirt1/PGC-1α信号途径，减轻氧化应激损伤，抑制细胞凋亡，发挥神经细胞保护作用[6]。山奈酚可通过抑制神经源性炎症反应起到减轻大鼠脑缺血再灌注损伤，起到脑保护作用，其抗炎机制可能与抑制NF-κB通路的激活有关[7]。β-谷甾醇因具有抗炎、镇痛、抗氧化等广泛的药理活性[8-10]。这些成分在网络中Degree值较高，可知苗药定痛汤中化合物可以从多方面发挥治疗作用。

在通路富集分析中发现20条关键通路，其中Pathways in cancer是极为复杂的代谢通路，内含环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate,cAMP)、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)、P13K/Akt、NF-κB、IL-6等多条通路，其中，P13K/Akt通路同样位于富集分析排名中的前20。在交集基因中有29个富集在该通路中，且P值排在前20中也多参与这些通路。NF-κB和MAPK是偏头痛进程中的重要通路，与上调下游炎性介质的释放、介导神经源性炎症相关[11-12]。PPI网络核心基因中的SIRT1不仅对血管性痴呆大鼠炎性通路NF-κB通路具有明显的负向调控作用[13]，还可通过调控PI3K/AKT信号通路降低高糖刺激心肌 H9c2 细胞的凋亡率和氧化应激反应[14]，调控 MAPK 信号通路改善脂毒性诱导的肝细胞损伤[15]。另外，SIRT1可通过去乙酰化核心基因中的FOXO3a对抗氧化应激损伤[16]。这提示苗药定痛汤可能通过干预上述通路和靶点发挥治疗偏头痛的作用。

通过网络药理学的研究方法，对苗药定痛汤治疗偏头痛可能的分子机制进行探索分析。共筛选出苗药定痛汤129个潜在活性成分和69个潜在治疗靶点；GO分析包含生物学过程582个条目、分子功能60个条目，细胞组分64个条目。KEGG通路富集筛选出73条枢纽通路，发现其作用机制可能与P13K/Akt、MAPK、NF-κB、SIRT1等多条信号通路相关。提示苗药定痛汤治疗偏头痛可能通过干预上述通路发挥作用，其中SIRT1与以上通路均存在密切联系，我们将在后续研究中以SIRT1通路作为切入点，对苗药定痛汤干预偏头痛的药效作用机制进行探索研究。