防己黄芪汤对三阴性乳腺癌细胞MB-MDA-231抑制作用研究

杨俊锋，郝艳方，王福科，裴晓华

(北京中医药大学房山医院外科，北京 102400)

三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)主要是指癌组织经过免疫组织化学检查，发现雌激素受体(Estrogen receptor,ER)、孕激素受体(Progesterone receptor,PR)和人表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor 2,Her-2)均为阴性的一种乳腺癌[1-2]。TNBC因其肿瘤体积较大，异质性较高，分化低，同时C-KIT、 P53及EGFR多表达为阳性，增殖、扩散速度较快，所以使其具有很高的侵袭性[3]。TNBC具有易转移、易复发、易死亡且预后差等特点，其中，转移多发生于内脏及软组织，如肺转移、肝转移、脑转移，但骨转移发生相对较少[4]。有研究发现非三阴性乳腺癌患者的5年生存率为80%，而TNBC患者的5年生存率仅为70%[5-7]。防己黄芪汤出自《金匮要略》，由防己、黄芪、白术、炙甘草4味药组成，用法中加入了生姜、大枣。临床上我们也常用防己黄芪汤加减方治疗乳腺癌患者术后综合治疗期的病症，该方在改善术后上肢水肿、缓解患者疲劳程度、增强机体免疫力以及降低肿瘤标志物等方面均具有一定的疗效[8-11]。另外不少研究也证实防己黄芪汤中黄芪、防己、白术中有效成分具有明确的抗肿瘤作用[12-15]。中医药治疗乳腺癌相关文献证治用药规律研究发现：高频次药物统计结果中黄芪、甘草、白术分别位列第1、5、7位[16-17]。因此，防己黄芪汤中大部分组成药物为治疗乳腺癌的常用药物。综上，本研究选择三阴性乳腺癌细胞MB-MDA-231为对象，观察防己黄芪汤对其抑制作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人三阴性乳腺癌细胞株MB-MDA-231，购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂：RPMI-1640培养基，美国Hyclone公司，产品批号：11875093；胎牛血清，中国ExCell公司，产品编号：FND500；磷酸盐缓冲液(PBS)，中国凯基公司；0.25% EDTA胰蛋白酶，美国Invitrogen公司；青链霉素，美国Invitrogen公司；MTT(四甲基偶氮唑盐)，中国Genebio公司；二甲基亚砜(DMSO)，美国Ameresco公司；Annexin VFITC Apoptosis Detection Kit I，美国BD公司；Transwell板，美国Corning公司。实验用药防己黄芪汤(防己、黄芪、炙甘草、白术、生姜、大枣)由北京中医药大学第三附属医院中药房负责提供。

1.2.2 仪器：超净工作台(中国月坛牌)；细胞培养箱(Themo HERAcell240 i，美国)；全自动酶标仪(Tecan，瑞士)；倒置相差显微镜(OLYMPUS，CKX53，日本)；低速离心机(京立LD5-2B，中国)；流式细胞仪(BD，美国)高压消毒锅(TOMY SX-500，日本)；-80 ℃冰箱(Themo，美国)；冰箱(海尔，中国)；微量移液器(Eppendorf，德国)；96孔板、细胞培养皿、EP管、冻存管等(Corning，美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养：将人三阴性乳腺癌细胞MB-MDA-231置于含有10%胎牛血清、1%青/链霉素溶液的1640培养基中，放置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中进行恒温培养，每天通过倒置显微镜观察细胞生长状态及是否污染，隔日换液一次，每 2～3 d 进行消化、传代。

1.3.2 防己黄芪汤制备：按处方组成及比例(防己12 g，黄芪15 g，炙甘草6 g，白术9 g，生姜4片，大枣1枚)，称取十剂处方量，经过煎煮、过滤、浓缩，制成干燥固体颗粒，-20 ℃冰箱中密封保存。按照所需浓度准确称取防己黄芪汤浸膏至于PBS溶液中，超声处理，再水浴锅中孵育，离心，取上清液采用0.22 μm滤器过滤，制备为母液，储存于4 ℃冰箱中。使用时，采用1640培养基按比例稀释。

1.3.3 MTT实验：取对数增长期的MB-MDA-231细胞，用0.25% EDTA胰蛋白酶消化离心后，加入细胞培养液，配制细胞悬液浓度为5×104个/ml，充分混匀，接种于96孔板中，每孔分别为200 μl，每种药物浓度设6个复孔观察，周围孔分别加入200 μl PBS封边，防止液体蒸损耗。放置于37 ℃，5% CO2条件的细胞培养箱内培养，等到细胞贴壁生长，确认细胞状态良好后，实验组分别加入防己黄芪汤梯度浓度溶液(4、8、16、32、64 mg/ml)200 μl/孔，空白对照组加入1640溶液200 μl/孔。继续放置于37 ℃，5% CO2条件的细胞培养箱内培养。在细胞培养至24、48、72 h 3个时点时分别进行检测。在检测前4 h，向待测孔的每孔中加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，继续培养4 h后中止，将各孔中的液体吸弃干净，每孔继续加入150 μl DMSO，室温下震荡10 min，使甲瓒结晶充分溶解。使用酶标仪检测各孔的OD值(波长490 mm)，根据各组OD值计算细胞抑制率，实验重复3次以上。计算细胞抑制率计算公式：细胞抑制率=(1-药物组OD值/对照组OD值)×100%[18]。

1.3.4 流式细胞技术检测药物对细胞凋亡作用影响：取对数生长期状态良好的MB-MDA-231细胞，接种于6孔板，放置于37 ℃，5% CO2条件的细胞培养箱内培养至细胞贴壁，按照分组分别将不同浓度的药物加入各孔，继续放置于细胞培养箱中培养48 h。培养结束后收集细胞，1500 r/min，离心5 min，弃上清，加入4 ℃ PBS，轻轻震荡，清洗2次，1500 r/min，离心5 min，弃上清，将细胞悬于0.1 ml Binding Buffer，调整浓度为1×105个。各管中加入5 μl PI和5 μl AnnxinV，避光，室温下静置15 min后，再向各管中加入0.4 ml Binding Buffer，通过500 mm滤网过滤，上流式细胞仪检测，经过计算机软件处理后，得出各细胞的周期及凋亡细胞百分比。

1.3.5 Transwell检测药物对细胞体外侵袭力影响：将所有吸头、小管及培养液提前预冷，将Matrigel胶按照1∶8的比例用RPMI-1640培养基稀释，操作均在冰盒上进行，以避免Matrigel室温条件下成胶。取对数生长的MB-MDA-231细胞，配制不同浓度的细胞悬液，调整浓度为1×105/ml，备用。将稀释后的Matrigel胶加入Transwell小室上室，使液体均匀分布于小室底面，放置于37 ℃培养箱内培养2 h后，取出小室，吸弃小室内残留液体。Matrigel基质层再次水化，完成后，将全部小室移至新的24孔板中，小心吸弃上室中的培养基。而后在上室每孔中加入细胞悬液500 μl，下室每孔中加入含有30%胎牛血清的细胞培养液750 μl。放入37 ℃，5% CO2条件的细胞培养箱内培养48 h后，倒扣小室，吸弃培养液，用PBS清洗小室上室，用棉拭子轻轻擦去上室内非侵袭细胞，加入甲醛，固定10 min。随后加入用PBS稀释后的DAPI染色液10 μg/ml，对其避光染色30 min。在荧光倒置显微镜(×400)下观察细胞计数，每个小室选取上中下左右5个视野，对其进行穿膜细胞的计数，重复3次，并分别在×100，×200，×400视野下观察拍照。

2 结 果

2.1 防己黄芪汤可体外抑制人三阴性乳腺癌细胞MB-MDA-231增殖 见表1。不同浓度的防己黄芪汤(4、8、16、32、64 mg/ml)作用于MB-MDA-231细胞24、48、72 h后，抑制率在一定浓度范围内和作用时间呈正相关性。防己黄芪汤浓度在32 mg/ml和64 mg/ml条件下，作用48 h和72 h后，对细胞抑制率没有明显增加(P>0.05)。在相同时间条件下，不同浓度的防己黄芪汤随着浓度的提升，对细胞的抑制率也成上升状态，且各浓度之间比较，具有明显差异(P<0.05)。防己黄芪汤在24、48、72 h对MB-MDA-231细胞IC50浓度分别为：7.35、6.50、5.28 mg/ml。考虑到高浓度药物对细胞渗透性影响，因此，后续实验采用的防己黄芪汤浓度为4 mg/ml(低浓度组)、8 mg/ml(中浓度组)和16 mg/ml(高浓度组)，观察时点为24 h。

表1 不同浓度防己黄芪汤对MB-MDA-231细胞抑制率(%)

2.2 防己黄芪汤可明显改变人三阴性乳腺癌细胞MB-MDA-231形态 对照组MB-MDA-231 细胞贴壁，生长良好，呈长梭形，或多边形，细胞个体饱满，胞质丰富，轮廓清晰，呈簇状聚集。防己黄芪汤高浓度组可见到培养基颜色随培养时间延长而逐渐变黄，且高倍(×200) 倒置显微镜下仅可见很少的贴壁细胞，多散在排列，部分细胞体积改变，胞浆内出现空泡变性，细胞结构不完整，裂解成碎片(图 1)。

A:对照组；B:防己黄芪汤高浓度组

2.3 防己黄芪汤可诱导人三阴性乳腺癌细胞MB-MDA-231凋亡 防己黄芪汤浓度低、中、高浓度作用于人乳腺癌MB-MDA-231 细胞24 h后，总凋亡率分别为(38.78±3.78)%、(48.37±4.29)%和(77.21±3.89)%，对照组总凋亡率为(9.78±2.37)%，防己黄芪汤组明显高于对照组，且差异有统计学意义(P<0.05)。防己黄芪汤低、中、高浓度作用24 h后引起MB-MDA-231细胞早期凋亡率分别为(29.62±2.56)%、(27.50±3.76)%和(46.38±2.67)%，与对照组(3.32±1.22)%相比，差异均有统计学意义(均P<0.05)，但低浓度和中浓度组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。对于MB-MDA-231 细胞晚期凋亡率影响方面，防己黄芪汤低、中、高浓度组分别为(8.76±1.02)%、(23.21±2.01)%和(30.78±2.38)%，与对照组(6.25±1.24)%相比，差异均有统计学意义(均P<0.05)。防己黄芪汤作用24 h能够提高MB-MDA-231细胞的总凋亡率、早期凋亡率和晚期凋亡率，其中提高早期凋亡率更为明显(图2)。

A:对照组；B:防己黄芪汤低浓度组；C:防己黄芪汤中浓度组；D:防己黄芪汤高浓度组

2.4 防己黄芪汤可体外抑制MB-MDA-231侵袭力 选取400倍镜下计数结果，防己黄芪汤低、中、高浓度处理24 h后，MB-MDA-231，穿膜细胞数分别为(28.22±3.00)个、(20.78±3.10)个和(12.67±3.78)个，与对照组(36.67±4.45)个相比明显减少，差异均有统计学意义(均P<0.05)。防己黄芪汤对MB-MDA-231侵袭力抑制力随药物浓度的增加而增强(图3)。

A:对照组；B:防己黄芪汤低浓度组；C:防己黄芪汤中浓度组；D:防己黄芪汤高浓度组

3 讨 论

TNBC是乳腺癌中的一种特殊亚型，因其具有复发率高、侵袭力强及预后差的特点，如何能提高疗效仍然是现在临床面临的瓶颈问题，虽然近年来在生物学和临床试验研究方面取得了一定的进展，但仍然没有找到针对性强，效果显著的治疗方案[19]。因此，临床上仍然亟需探索出好的治疗思路和有效的药物。中医中药发展历史悠久、理论基础深厚、干预方法多样，这将可能为解决此临床难题提供新的思路和切入点。通过合理地辨证使用中医药能够改善乳腺癌患者的生存质量，减轻放、化疗的毒副作用，调节免疫功能，抑制肿瘤生长，延长患者的带瘤生存期[20]。乳腺癌属于中医学“乳岩”范畴。中医学认为，乳腺癌发生的本质是本虚标实，正气虚衰为本，气滞、痰凝、血瘀、邪毒内蕴为标，乳腺癌的发生是因虚致实，因实而虚，虚实夹杂的复杂病理过程。防己黄芪汤从方义分析上似乎与乳腺癌的病因病机并不能一一对应，但是正如前文中所提及其药方组成药物都具有一定抗肿瘤特性，加之中药复方具有“多成分、多靶点、多机制”的特点[21]。因此，选择对中药复方的抗肿瘤作用机制进行研究，可能会成为治疗肿瘤的新希望。本课题组也一直致力于中医药防治乳腺癌的研究，多年研究也发现防己中有效成分粉防己碱在体外对乳腺癌MDA-MB-435S细胞及HCC1937细胞的增殖及侵袭力具有明显的抑制作用，并可明显诱导细胞凋亡，其抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡的机制可能与调控Bcl-2、Bax、Bid、caspase-3等相关。

本研究已初步证实了防己黄芪汤能体外抑制人三阴性乳腺癌细胞MB-MDA-231增殖，诱导细胞凋亡，并且对其侵袭力也具有一定抑制作用，为中医药治疗TNBC提供了一定数据支持。但是对于细胞抑制作用中的具体分子机制和分子靶点的理论机制还需要进一步探索和研究。