卵裂期无可移植胚胎患者行囊胚培养后早期囊胚的最佳移植策略

詹少泉，刘寒艳，杜红姿，李 莉，康祥锦，李 磊

（广州医科大学附属第三医院生殖医学中心//广东省生殖医学重点实验室//广东省产科重大疾病重点实验室//广东省普通高校生殖与遗传重点实验室，广东广州 510150）

辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）中卵裂胚胎的形态评分是基于胚胎发育形态的不同，在一定程度上可以预测着床率。许多研究［1-3］支持胚胎质量与获得成功着床和最终活产之间的关系。另一种有助于提高成功率的方法是囊胚培养，由于囊胚非整倍体率降低［4］，囊胚移植可以改善胚胎移植结局。临床上有部分预后差的患者，在卵裂期胚胎评分没有达到可移植的标准，在后续周期中可能面临同样的无可移植胚胎问题。已有研究针对有3 个以上优质卵裂胚胎行囊胚培养后发育迟缓的患者进行分析［5］，并没有对无可移植胚胎行囊胚培养后发育迟缓的患者进行分析。而且目前尚未有研究进一步分析Ⅰ期囊胚和Ⅱ期囊胚新鲜移植结局的差异。尤其是Ⅰ期囊胚，是进行鲜胚移植，还是继续延长培养进行玻璃化，并在随后的解冻周期中移植，以使胚胎和子宫内膜同步化，获得更好的妊娠结局？本研究拟回顾性比较卵裂期无可移植胚胎的患者，在第5 天新鲜移植Ⅰ期，Ⅱ期囊胚，同时与同一队列患者FET 第6 天扩张囊胚及第3 天移植Ⅱ级胚胎的患者相比，临床结局是否有差异，以评估卵裂期无可移植胚胎患者，行囊胚培养移植的安全性，早期囊胚新鲜移植的妊娠结局，以及更好的胚胎-子宫内膜同步化对妊娠结局的改善作用，从而探讨最佳的移植策略。

1 材料与方法

1.1 研究对象

我们对2014年1月至2019年12月期间卵裂期无可移植胚胎行囊胚培养，第5 天移植的178 个移植周期（GardnerⅠ期囊胚97 个周期，Ⅱ期囊胚81个周期）进行了回顾性队列分析，并设置了两个对照组，第3天为2级胚胎的卵裂胚新鲜移植周期（对照组1，n=754），卵裂期无可移植胚胎行囊胚培养，第6 天冷冻囊胚的FET 周期（对照组2，n=144），并将对照组与研究组进行基线匹配。研究组和对照组均为单囊胚或单胚胎移植周期。纳入标准如下：卵巢刺激开始时母亲年龄<44岁，选择性新鲜或解冻周期单胚胎移植。排除标准如下：PGT；二次冷冻；辅助孵化。同一组中每名患者只纳入一次统计。该研究征得患者知情同意并获得医院伦理委员会的批准。

1.2 方 法

1.2.1 卵巢刺激和胚胎培养移植 使用以下三种方案之一进行卵巢刺激：GnRH 激动剂方案，GnRH拮抗剂方案或非常规方案。当至少两个卵泡直径>17 mm 时，用4 000～10 000 U 的hCG 诱导最终的卵母细胞成熟。在hCG触发后34～36 h进行卵母细胞采集。

传统的体外受精（in vitro fertilization，IVF）或卵胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injec⁃tion，ICSI）根据是否存在男性因素而进行。胚胎在覆盖矿物油（ovoil，vitrolife）的G1 Plus 培养基（vitrolife）的25 μL 液滴中单独培养，并在37 ℃和体积分数6% CO2的培养箱中孵育。第3 天的一些胚胎随后在G2 Plus 培养基（vitrolife）中，使用三气培养箱（体积分数5% O2/6% CO2/89% N2）培养至第5/6 天。受精在授精/注射后16～18 h 进行评估，并在第2、3、5 和6 天进行胚胎质量评估。

第3 天可移植胚胎评分标准为：5～12 个细胞，≤20%碎片，卵裂球大小均一或不完全均等大小，<50%空泡，<50%多核。不符合上述标准的胚胎被定义为不可移植胚胎。1 级胚胎评分标准为：7～9 细胞，≤20%碎片，卵裂球大小均一；其他可移植胚胎为2级胚胎。以上所研究的胚胎在第1天均为正常受精胚胎。

在囊胚阶段，根据Gardner 分类法在第5 天和第6 天评估胚胎质量，该分类考虑了扩张等级以及内细胞团（ICM）和外滋养层（TE）的发育情况［6］。Ⅰ期囊胚为囊胚腔体积<50%，未扩张；Ⅱ期囊胚为囊胚腔体积≥50%，未扩张；囊胚在3～6 级扩张、ICM 和TE 的发育至少达到一个B 级或以上时冷冻。

根据临床方案，在第3 天或第5 天下午进行新鲜移植。在囊胚培养中没有3 级以上囊胚的情况下，移植具有最佳质量的胚胎并将其他胚胎培养至第6 天。在第6 天达到冷冻标准行玻璃化冷冻，丢弃所有其他胚胎。

新鲜移植后的黄体期支持根据方案不同而定，拮抗剂方案或微刺激方案由戊酸雌二醇（6 mg/d）和微粒化黄体酮（300 mg/d）组成，激动剂方案仅需微粒化黄体酮（300 mg/d），均在卵母细胞取出当天开始并持续至妊娠8～10周。

1.2.2 FET 内膜准备、囊胚玻璃化冷冻和复苏 根据月经和排卵情况，准备冷冻胚胎移植的患者采用自然周期或人工周期。在人工周期中，在月经第2天和第3 天开始每天口服戊酸雌二醇（6 mg），持续11 d，在合适的条件下（如子宫内膜厚度≥8 mm，孕酮<4.5 nmol/L），在黄体酮转化的第6天进行胚胎移植。如果未达到该厚度，则视情况调整戊酸雌二醇的剂量。如果子宫内膜厚度仍不足或孕酮水平高于4.5 nmol/L，则取消胚胎移植。黄体支持持续到妊娠8～10周。

囊胚玻璃化冷冻和复苏具体见之前已发表的文献［7］，采用商品化试剂盒，在玻璃化冷冻之前，先进行激光人工囊胚皱缩，冷冻过程在37 ℃下，ES液中2 min，VS中45～60 s。然后用最小体积的玻璃化溶液将囊胚装载到冷冻载体Cryotop 顶端，并立即在-196 ℃下浸入液氮中。复苏时，迅速将Cryotop顶端置于37 ℃的TS中1 min，然后在室温下依次将胚胎转入DS、WS1、WS2中各3 min。最后将存活的囊胚移入平衡过的培养液中，置于37 ℃、6%CO2的培养箱中培养等待移植。培养2～4 h后在超声引导下进行宫内移植。

1.2.3 临床结局 主要结果是活产率（LBR），即胚胎移植后在妊娠≥28 周时产下一个存活的婴儿。次要结果包括临床妊娠率（CPR）、早期流产率（EMR）、持续妊娠率（OPR）和新生儿情况。临床妊娠率是通过超声记录至少一个胎儿在妊娠6～7 周时有心跳来确定的。EMR 定义为妊娠12周前的宫内妊娠丢失。OPR 定义为12 周后怀孕。新生儿情况包括：平均孕周，胎儿体质量，身高。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，不符合正态分布的计量资料用中位数和四分位数描述，即M（P25～P75）。对于正态或非正态分布资料分别采用两独立样本t检验或Mann-Whitney’sU检验，计数资料用率（%）表示，采用χ2检验或Fisher 精确概率法。P<0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

与新鲜周期2 级卵裂胚胎移植组（对照组1）相比，第5 天的Ⅰ期和Ⅱ期囊胚移植组的获卵数均显著高于对照组1（P<0.05），其余指标包括获卵年龄，不孕年限，抗缪勒氏管激素（anti-Mullerian hormone，AMH），体质量指数（body mass index，BMI），原发不孕比例，不孕原因，卵巢刺激方案，HCG 日内膜厚度，授精方式差异均没有统计学意义（表1）。

新鲜周期第5 天的Ⅰ期和Ⅱ期囊胚移植组与新鲜周期2级卵裂胚胎移植组（对照组1）结局的比较。活产率Ⅰ期囊胚移植组显著低于2 级卵裂胚胎移植组（对照组1；7.22%vs.18.83%，P<0.01），临床妊娠率（11.34%vs.25.33%，P<0.01）和继续妊娠率（7.22%vs.19.89%，P<0.01）Ⅰ期囊胚移植组也显著低于对照组1，早期流产率和新生儿情况（出生孕周，身高，体质量）两组差异没有统计学意义（P>0.05，表2）。Ⅱ期囊胚移植组与对照组1 相比，活产率，临床妊娠率，早期流产率，继续妊娠率以及新生儿情况两组差异均没有统计学意义（P>0.05；表2）。

表1 与新鲜周期2级卵裂胚胎移植相比，Ⅰ期和Ⅱ期囊胚移植的基础参数Table 1 Analysis of the basic and treatment characters of Stage I and Stage Ⅱblastocyst transfer compared with grade 2 cleavage embryo transfer in fresh cycles ［（±s），M（P25～P75），n（%）］

表1 与新鲜周期2级卵裂胚胎移植相比，Ⅰ期和Ⅱ期囊胚移植的基础参数Table 1 Analysis of the basic and treatment characters of Stage I and Stage Ⅱblastocyst transfer compared with grade 2 cleavage embryo transfer in fresh cycles ［（±s），M（P25～P75），n（%）］

P1：Stage I blastocys vs. grade 2 embryos（Control 1）；P2：Stage Ⅱblastocys vs.grade 2 embryos（Control 1）；AMH：anti-Mullerian hormone；BMI：body mass index；IVF：in vitro fertilization；ICSI：intracytoplasmic sperm injection

与来源于第3 天无可移植胚胎，行囊胚培养后的第6 天冷冻囊胚移植组（对照组2）相比，新鲜周期第5 天的Ⅰ期和Ⅱ期囊胚新鲜移植组AMH 均显著低于对照组2（P<0.05），其余指标如获卵年龄，不孕年限，BMI，原发不孕比例，不孕原因，卵巢刺激方案，HCG 日内膜厚度，授精方式两组差异均没有统计学意义（表3）。

新鲜周期第5 天的Ⅰ期和Ⅱ期囊胚移植组与第6天冷冻囊胚移植组（对照组2）结局的比较。活产率I期囊胚移植组显著低于第6 天冷冻囊胚移植组（对照组2；7.22%vs.15.97%，P<0.05），临床妊娠率（11.34%vs.24.31%；P<0.05）和继续妊娠率（7.22%vs.15.97%；P<0.05）I 期囊胚移植组也显著低于对照组2，早期流产率和新生儿情况（出生孕周，身高，体质量）两组差异均没有统计学意义（P>0.05；表2）。Ⅱ期囊胚移植组与对照组2 相比，活产率，临床妊娠率，早期流产率，继续妊娠率以及新生儿情况两组差异均没有统计学意义（P>0.05；表4）

表2 在新鲜周期、Ⅰ期和Ⅱ期囊胚移植与2级卵裂胚胎移植的结果比较Table 2 In the fresh cycles，the outcomes of Stage I and Stage Ⅱblastocyst transfer compared with grade 2 cleavage embryo transfer ［（±s），n（%）］

表2 在新鲜周期、Ⅰ期和Ⅱ期囊胚移植与2级卵裂胚胎移植的结果比较Table 2 In the fresh cycles，the outcomes of Stage I and Stage Ⅱblastocyst transfer compared with grade 2 cleavage embryo transfer ［（±s），n（%）］

P1：Stage I blastocys vs.grade 2 embryos（Control 1）；P2：Stage Ⅱblastocys vs.grade 2 embryos（Control 1）

表3 与第6天冷冻囊胚移植组相比，Ⅰ期和Ⅱ期囊胚新鲜移植的基础参数Table 3 Analysis of the basic and treatment characters of fresh Stage I and Stage Ⅱblastocyst transfer compared with D6 vitrified blastocyst transfer ［（±s），M（P25～P75）］

表3 与第6天冷冻囊胚移植组相比，Ⅰ期和Ⅱ期囊胚新鲜移植的基础参数Table 3 Analysis of the basic and treatment characters of fresh Stage I and Stage Ⅱblastocyst transfer compared with D6 vitrified blastocyst transfer ［（±s），M（P25～P75）］

P'1：Stage I blastocys vs.D6 blastocyst in FET cycles（Control 2）；P'2：Stage Ⅱblastocys vs.D6 blastocyst in FET cycles（Control 2）；AMH：anti-Mullerian hormone；BMI：body mass index；IVF：in vitro fertilization；ICSI：intracytoplasmic sperm in⁃jection

表4 新鲜周期Ⅰ期和Ⅱ期囊胚移植与第6天冷冻囊胚移植的结果比较Table 4 Outcomes of fresh Stage I and Stage Ⅱblastocyst transfer compared with D6 vitrified blastocyst transfer ［（±s），n（%）］

表4 新鲜周期Ⅰ期和Ⅱ期囊胚移植与第6天冷冻囊胚移植的结果比较Table 4 Outcomes of fresh Stage I and Stage Ⅱblastocyst transfer compared with D6 vitrified blastocyst transfer ［（±s），n（%）］

P'1：Stage I blastocys vs.D6 blastocyst in FET cycles（Control 2）；P'2：Stage Ⅱblastocys vs.D6 blastocyst in FET cycles（Control 2）

3 讨论

鉴定具有植入能力并能健康怀孕的胚胎（囊胚）是IVF 的关键部分，需要更多信息来确定在新鲜胚胎移植中应移植哪些胚胎，应进行玻璃化或应丢弃哪些胚胎。

在本研究中，我们的目的是确定卵裂期无可移植胚胎的患者，是否通过囊胚培养能获得较好的临床结局，将胚胎培养延长至第6 天来推迟发育迟缓的囊胚的移植，并在随后的FET 周期中移植该囊胚是否可以产生更好的妊娠结局。包括的胚胎为卵裂期不可移植胚胎，且囊胚发育缓慢，并且仅包括新鲜和FET 的单胚胎移植以避免处于不同发育阶段的胚胎一起移植。本研究结果同先前报道的结果一致，早期囊胚新鲜移植能获得与FET 第6 天扩张囊胚相似的结局［5］。但是，我们进一步分析了Ⅰ期囊胚和Ⅱ期囊胚移植的结局，并与卵裂期2 级胚胎移植进行比较，我们的结果证实了Ⅰ期囊胚可以继续延长培养，直到达到第6 天扩张囊胚，然后在随后的FET 周期中进行移植，而Ⅱ期囊胚可以行新鲜周期移植，同时我们也证实了卵裂期不可移植胚胎来源的Ⅱ期囊胚临床结局和卵裂期2 级胚胎移植结局相似，可以增加这类患者的移植率和改善妊娠结局。

Ⅰ期囊胚新鲜周期低临床妊娠率的可能原因：由于发育相对缓慢，这些胚胎中有绝大部分在第6天仍不能达到扩张囊胚，因此，胚胎-子宫内膜不同步导致新鲜周期不能成功植入。

有研究［8］表明，与第5 天囊胚相比，在第7 天达到囊胚然后FET 具有可接受的LBR（25.15%vs.46.5%，P<0.01），并且新生儿体质量，畸形发生率或新生儿死亡没有差异。因此，将胚胎培养延伸到第6 天以后，这可能是一种合适的策略，特别是在发育迟缓的情况下，可以继续培养至第6 天甚至第7 天。这可以提高适合冷冻保存的胚胎的数量并改善临床结局。

Campbell［9］发现，发育迟缓的囊胚具有更高的非整倍体风险，是否需要用PGS 检测囊胚，尤其是来源于差质量卵裂胚的囊胚，我们不推荐PGS用于那些只有低质量第3 天胚胎的患者。因为我们的结果显示，差质量卵裂胚患者的Ⅱ期囊胚可以获得与第3 天2 级卵裂胚相似的结果。一些研究［10-11］也表明PGS 并不能改善所有患者的总体预后。而且，关于PGS方法的临床和经济效益仍存在相当大的争议［12］。

我们的研究有一些局限性。首先，这项研究是回顾性设计，因此，可能会引入一些偏倚。第二，不同的差质量卵裂胚的定义会影响结果。我们的定义为第3 天<5 细胞，或>12 细胞，且满足以下的一个条件：>20%碎片，卵裂球大小严重不均等，≥50%空泡，≥50%多核。第三，我们中心70%的患者接受了双胚移植。单囊胚移植的标准为医学指征或仅有一个囊胚，限制了本研究的样本量。第四，本研究仅针对卵裂期无可移植胚胎的患者，是否可以扩展到所有行囊胚培养的患者，这需要进一步的研究。

总之，我们的研究结果表明，对于卵裂期不可移植胚胎行囊胚培养，发育迟缓的I 期囊胚继续延长培养后FET 移植，Ⅱ期囊胚新鲜移植，可导致较高的临床妊娠率和活产率。因此，胚胎-子宫内膜同步性，改良的胚胎选择过程，这两个主要因素可能起重要作用。