PTBP1介导长链非编码RNA RP11-879F14.2发挥抑制心肌纤维化的作用

杨 莹，郭 晶，温艺红，黄宇晴，易芷瑶，朱杰宁，方咸宏，单志新，，，4

（1.华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州 510006；2.华南理工大学医学院，广东广州 510006；3.广东省临床药理学重点实验室//广东省人民医院//广东省医学科学院，广东广州 510080；4.南方医科大学第二临床医学院，广东广州 510280）

心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）是心肌组织中细胞外基质过度沉积并伴有胶原蛋白比例或胶原成分发生变化，引起心的硬度增加，弹性下降，顺应性发生改变，心输出量与供血能力受到严重影响，最终导致心肌功能障碍直至心衰的发生［1-2］。尽管目前所用的肾素-血管紧张素-醛固酮系统阻滞剂等抗纤维化药物可延缓心肌纤维化的进展，但并不能从根本上预防和治疗此类疾病，因此，研究并阐明心肌纤维化发生的病理生理学机制，发现关键的干预靶点对于心肌纤维化的治疗具有非常重要的意义［3］。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类核苷酸长度大于200 nt 并且缺乏蛋白质编码功能的转录本，与编码蛋白的mRNA 相比，lncRNA 同样由RNA 聚合酶Ⅱ或聚合酶Ⅲ转录而来，多数具有5’帽子和3’端多聚尾，但其物种间的保守序列小于10%，表达丰度不高，具有较强的组织和细胞特异性［4-6］。研究发现，ln⁃cRNAs可作为“分子信号”、“支架”和“诱饵”等与不同分子结合，在表观调控、转录以及转录后调控等多个层面参与基因表达的调节［7-8］。研究显示ln⁃cRNAs与心力衰竭的发生密不可分，并且参与心肌纤维化的发生过程［9-10］，深入探究lncRNAs 调节心肌纤维化的作用机制，对于心肌纤维化的治疗研究有重要意义。本文中，我们通过分析心衰患者与健康人心肌组织的lncRNA 表达谱，选取在心衰患者心肌中表达显著增加的lncRNA RP11-879F14.2，并探讨其调控心肌纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 组织标本

利用心衰病人和健康器官捐献者的心肌组织进行lncRNA 表达谱分析和RP11-879F14.2 表达的定量PCR 检测。心衰病人和健康器官捐献者均知情同意，基本资料见表1。利用房颤（atrial fibrilla⁃tion，AF）病人（持续出现房颤的时间不低于1 年）、窦性心律（sinus rhythm，SR）病人左心耳切除术后废弃的新鲜心耳组织及无心源性疾病的器官捐献者的新鲜心耳组织进行心房肌成纤维细胞的分离。

本研究经广东省人民医院伦理委员会批准【批准号No.GDREC2019238H（R1）】，手术标本来源：广东省心血管病研究所。

1.2 主要试剂

Masson三色染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；限制性内切酶XhoI、EcoR I、PacI 和PmeI（NEB）；BJ5183E.Coli、载体pAd-Track-cmv vector和pAd-EasyⅠ（Colon cancer）；DMEM/F12 细胞培养基、特级澳洲胎牛血清、2.5 g/L EDTA-胰蛋白酶（Gibco）；100×青-链霉素混合抗生素（solarbio）；转染试剂Lipofectamine 2000、核质分离试剂盒和TRIzol 试剂（Invitrogen）；逆转录试剂盒、2×SYBR Green Mix、4×SDS loading buffer 和RNase free water（TaKaRa）；si-PTBP1（广州锐博）；SDS-PAGE 凝胶配置试剂盒（碧云天）；GAPDH 抗体、COL1A1抗体、COL3A1 抗体（Protein Technology）；α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体（Ab⁃cam）；BCA 蛋白定量试剂盒（Thermo）；蛋白Marker（Fermentas）；ECL 发 光 液（Millipore）；PVDF 膜（Whatman）；血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Sigma）。其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。所用引物由Invitrogen公司合成，具体序列见表2。

表1 患者临床资料Table 1 Clinical characteristics of the patients with heart failure and healthy organ donors

1.3 主要方法

1.3.1 Masson三色染色 剪取临床外科手术废弃的新鲜心耳组织，用40 g/L 多聚甲醛固定过夜后，逐步脱水、透明、浸蜡、包埋后制作4 μm 厚度的连续石蜡切片，用Masson 三色染色试剂盒逐步染色胶原纤维，观察心肌组织的胶原纤维沉积情况，选择八个单独的视野（放大倍数=原始×400）计算心肌胶原纤维所占比例（CVF），CVF=胶原区域/总面积。

表2 PCR引物序列Table 2 The sequences of the primers for RT-qPCR

1.3.2 LncRNAs 表达谱芯片分析 取各5 份心衰病人和健康捐献者的心肌组织进行lncRNAs 表达谱分析，由上海康成公司协助完成芯片的杂交和结果分析。主要实验步骤：利用TRIzol试剂提取人心肌组织总RNA，用随机引物进行转录，扩增后与lncRNAs 表达谱芯片（Arraystar human lncRNA Ar⁃ray）上的寡核苷酸cRNA 探针（Arraystar Super RNA labeling kit）进行杂交反应。杂交后经Agilent Scan⁃ner G2505 扫描并上传数据，最后由Feature Extrac⁃tion Software进行数据处理和结果分析。

1.3.3 人心房肌成纤维细胞（HAFs）的分离、培养和处理 参考我们已报道方法［11］，用冷PBS清洗左心耳，只剪取近心房组织，去除淤血。用0.25%EDTA-胰蛋白酶消化法分离心房肌成纤维细胞。离心弃上清，沉淀用完全培养液（含100 mL/L 胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM/F12 培养液）重悬，接种于25 cm2细胞培养瓶中，再置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养。培养24 h 后，更换一次完全培养液。待细胞密度达90%时，消化传代。本实验使用的HAFs 为P3-P5。分别将重组腺病毒rAd-lncRNA RP11-879F14.2、rAd-PTBP1感染HAFs，以rAd-GFP（MOI=10）作为对照，感染后于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。用lipofectamine2000 试剂将100 nmol/L si-NC 阴性对照，si-PTBP1 分别转染至HAFs 中，并在37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养24 h，收集细胞，进行后续测定。

1.3.4 lncRNA RP11-879F14.2 和PTBP1 重 组 腺 病毒的制备 根据我们报道的方法［12］，分别将RP11-879F14.2 和PTBP1 的模板DNA 定向克隆到pAd-Track-cmv 载体上。然后，将pAd-Track-RP11-879F14.2、pAd-Track-PTBP1 分别 转 化入含pAd-Easy-I 骨架质粒BJ5183 的化学感受态大肠杆菌中进行同源重组。接着，将RP11-879F14.2、PTBP1的重组腺病毒质粒用限制酶PacI 线性化，并转染到HEK293T 细胞中进行病毒包装和扩增。同时，制备rAd-GFP作为对照空载腺病毒。

1.3.5 双荧光素酶报告基因实验 参照已报道方法［11］构建包含RP11-879F14.2 的重组萤光素酶报告质粒pGL3-RP11-879F14.2（基于pGl3-promoter载体）。利用人心肌AC16细胞，将AC16细胞（细胞密度约为1×105/每孔12 孔板）转染1.0 μg 重组荧光素酶报告质粒，500 ng pAd-Track-PTBP1 以及1 ng pRL-TK（表达海肾荧光素酶的内参照质粒）。转染24 h 后，测定萤火虫荧光素酶（firefly luciferase，FL）及海肾荧光素酶（renilla luciferase，RL）强度，两种荧光强度比值（FL/RL）变化可反映RP11-879F14.2与PTBP1间的结合能力。

1.3.6 实时定量PCR（RT-qPCR） 采用TRIzol 法提取总RNA 后，定量1.0 μg，用Oligo（dT）15和随机引物逆转录出cDNA。以Gapdh 作为内部参照，用相应的引物检测RP11-879F14.2、PTBP1 及纤维化相关基因的RNA 表达水平。在vii A7 Quantitative PCR System（美国Applied Biosystems）进行PCR 反应，以2-ΔΔCt法计算RP11-879F14.2 及纤维化相关基因的相对表达水平。

1.3.7 蛋白免疫印迹法（Western blot） 在处理后的HAFs 中，加入RIPA 蛋白裂解液，冰上裂解后收集细胞，超声后于4 ℃10 000×g转速离心15 min，取上清测定浓度后，进行蛋白定量分装。加入4×SDS loading buffer，99 ℃加热10 min使蛋白质变性，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。完成PVDF 膜转印蛋白后，加入5%脱脂牛奶至完全覆盖PVDF膜，封闭1 h，分别用相应的一抗anti-COL1A1（1∶1 000）、anti-COL3A1（1∶5 000）、anti-α-SMA（1∶5 000）、anti-PTBP1（1∶2 000）4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，加入二抗（1∶5 000）室温孵育1 h。ECL 发光试剂盒曝光显影，以GAPDH（1∶5 000）为内参照，Image J扫描灰度值并分析蛋白表达相对含量。

1.4 统计学方法

用SPSS 25.0 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，两组计量资料的均数比较，如果每一组资料都呈正态分布并且方差齐性，组间比较采用t检验，反之用校正t检验或秩和检验；多组均数比较，各组定量资料都呈正态分布并且方差齐性采用One way-ANOVA 进行分析，并用Bonferroni 校正的t检验进行组间两两比较，反之用Kruskal Wal⁃lisH检验。

2 结果

2.1 lncRNA RP11-879F14.2 在心衰患者心肌中表达增加

Masson 染色结果表明，与健康对照组相比，心衰患者心肌微血管周围和细胞间质的胶原沉积明显，发生显著的心肌纤维化（图1A）。LncRNA 表达谱芯片结果显示，心衰患者心肌的lncRNAs 表达谱发生改变，分别有230和262个lncRNAs呈2倍以上的表达上调和下调，其中lncRNA RP11-879F14.2在心衰心肌中升高表达2.81 倍（图1B）。RT-qPCR结果证实，与健康对照组相比，RP11-879F14.2 在心衰患者心肌组织中表达显著增加（P＜0.01；图1C）。

2.2 lncRNA RP11-879F14.2 富集于HAFs 的细胞核中

RT-qPCR 结果显示，在20 μmol/L Ang-Ⅱ处理的HAFs中RP11-879F14.2表达显著增加（P＜0.01；图2A）。核质RNA组分分离和RT-qPCR结果显示，在Ang-Ⅱ处理前后的HAFs 中，RP11-879F14.2 均主要分布在细胞核中（图2B、C）。

2.3 lncRNA RP11-879F14.2 抑制HAFs 中纤 维化相关基因表达

为进一步探究RP11-879F14.2 对HAFs 纤维化表型的影响，我们利用重组腺病毒rAd-RP11-879F14.2 在HAFs 过表达RP11-879F14.2，进而检测纤维化相关基因（Col1a1、Col3a1、Acta2）的表达。rAd-RP11-879F14.2 共表达的绿色荧光蛋白（GFP）显示rAd-RP11-879F14.2 已充分感染HAFs（图3A）。RT-qPCR 结果显示，腺病毒可充分介导RP11-879 F14.2 在HAFs 中过表达，同时引起HAFs 中纤维化相关基因表达显著降低（图3B）。Western blot 结果显示，过表达RP11-879F14.2 的HAFs 中Col1a1、Col3a1 和α-SMA 的表达显著降低（图3C）。

图1 lncRNA RP11-879F14.2在心衰病人心肌中表达增强Fig.1 Upregulation of lncRNA RP11-879F14.2 in the myocardium of patients with heart failure

图2 lncRNA RP11-879F14.2在HAFs中的核质分布情况Fig.2 Cellular distribution of lncRNA RP11-879F14.2 in the cytoplasm and nucleus of HAFs

图3 LncRNA RP11-879F14.2抑制HAFs中纤维化相关基因表达Fig.3 LncRNA RP11-879F14.2 inhibits fibrosis-related genes expression in HAFs

2.4 PTBP1 介 导lncRNA RP11-879F14.2 抑 制HAFs中纤维化相关基因表达

序列分析结果（http：//service.tartaglialab.com/page/catrapid_omics_group）提示，RP11-879F14.2 与PTBP1蛋白间存在结合作用，我们通过双荧光素酶报告基因实验结果证实，与PTBP1蛋白的结合可降低AC16 细胞中RP11-879F14.2 的稳定性（图4A）。Western blot结果显示，腺病毒介导有效表达RP11-879F14.2的HAFs中，PTBP1蛋白表达显著增加（图4B）。沉默HAFs中PTBP1表达，可显著逆转RP11-879F14.2抑制HAFs中纤维化相关基因表达的作用（图4C）。

3 讨论

心肌纤维化是引发心力衰竭的主要原因，其特征主要为成纤维细胞增殖，并向肌成纤维细胞转化，细胞外基质蛋白过度沉积，该过程可引起心脏室壁顺应性降低，舒缩功能减弱以及心脏传导异常等，最终导致心功能不全，进而引起心衰［13］。本文基于lncRNA 表达谱芯片和RT-qPCR 结果，证实RP11-879F14.2 在心衰患者心肌和AngII 诱导的HAFs 中表达均增强；功能研究发现在HAFs 中过表达RP11-879F14.2 可以显著抑制HAFs 中纤维化相关基因的表达，进而证实心衰时心肌中高表达的RP11-879F14.2具有抑制心肌纤维化的作用。

图4 PTBP1介导LncRNA RP11-879F14.2抑制HAFs中纤维化相关基因表达Fig.4 Participation of PTBP1 in attenuation of fibrosis-related genes expression by lncRNA RP11-879F14.2 in HAFs

研究表明，lncRNA 在心脏发育以及多种心血管系统疾病中发挥重要作用，可能成为多种心血管疾病提供治疗靶点。如慢性压力超负荷后的小鼠心肌成纤维细胞中lncRNA 母系表达基因3（mater⁃nally expressed gene3，Meg3）表达上调，沉默Meg3可降低p53 与基质金属蛋白酶-2（matrix metallo⁃peptidase 2，Mmp-2）启动子区域的相互作用，防止心肌Mmp-2 的诱导产生，促进心脏纤维化和压力超负荷后舒张功能受损［14］。在心肌梗死小鼠中促纤维化lncRNA PFL 可以通过内源性竞争吸附mi⁃croRNA let-7d，解除let-7d 对血小板活化因子受体的抑制作用，促进肌成纤维细胞生成［15-16］。为了探究RP11-879F14.2 抑制心肌纤维化的可能机制，通过核/质RNA 分离和RT-qPCR 检测，证实RP11-879F14.2 主要位于心肌细胞核中。鉴于核内ln⁃cRNA 一般通过RNA 结合蛋白来发挥生物学作用［17］，本文根据生物信息学分析（http：//service.tart⁃aglialab.com/page/catrapid_omics_group）结果，利用双荧光素酶报告基因实验来鉴定RP11-879F14.2与PTBP1 间可能的结合作用。我们利用pGl3-pro⁃moter 载体，将RP11-879F14.2 序列插入到萤火虫荧光素酶基因的3’端，证实增加PTBP1 表达后萤火虫荧光素酶基因表达降低，提示PTBP1与RP11-879F14.2间发生结合作用，进而降低萤火虫荧光素酶基因转录本的稳定性和表达。在后续研究中我们将通过RNA pull-down 和序列突变实验进一步明确RP11-879F14.2与PTBP1间的结合作用。

PTBP1属于核糖核蛋白家族，为基因表达过程中主要的剪接因子，该蛋白主要位于细胞核中，作为一种穿梭蛋白，PTBP1 可通过影响mRNA 剪接翻译等过程参与调控基因表达进程［18］，研究发现PTBP1 与细胞发育及癌症等多种疾病的发生发展密切相关［19-21］。LncRNA Meg3 可通过招募PTBP1蛋白促进shp mRNA 的降解，进而诱导胆汁淤积性肝损伤［22］。而在成纤维细胞重编程为心肌细胞过程中，PTBP1 会出现下调，表明PTBP1 为成纤维细胞获得心肌细胞特异性的剪接模式的一种关键的阻碍物［23］。

本文中，我们证实RP11-879F14.2 可与PTBP1相互作用，并可上调PTBP1 表达，而沉默PTBP1 可促进HAFs 中纤维化相关基因表达，并逆转RP11-879F14.2 抑制纤维化相关基因表达的作用，提示PTBP1 可介导RP11-879F14.2 发挥抑制心肌纤维化的作用。我们推测RP11-879F14.2 可能作为“支架”通过招募PTBP1而促进PTBP1调控与纤维化相关基因的表达，进而发挥抑制心肌纤维化的作用，但具体机制有待进一步研究证实。

综上，本文证实RP11-879F14.2 在心衰患者心肌中表达增强，通过结合PTBP1 发挥抑制HAFs 中纤维化相关基因表达的作用。在后续研究中，我们将继续探明RP11-879F14.2 与PTBP1 的结合作用及对其下游基因的调控作用，并在整体动物水平上进一步阐明PTBP1 介导RP11-879F14.2 抑制心肌纤维化的作用机制。