lncRNA ZFAS1靶向miR-193a-3p调控宫颈癌细胞Siha放射敏感性的分子机制研究

刘晓娟 王 静 张 娟 高月月 王 虹

(河北北方学院附属第一医院妇产科，张家口 075000)

宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，放射治疗是其主要治疗手段之一，放射治疗的效果与其放射敏感性密切相关，而临床上部分患者放射治疗效果不理想，对放射不敏感是其主要原因[1-2]。研究宫颈癌放疗敏感性的相关机制对克服宫颈癌患者的放疗耐受及延长患者生存期具有重要意义。有报道显示，长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和微小RNA(microRNA,miRNA)广泛参与宫颈癌的发生发展，且lncRNA可作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)与miRNA竞争性结合，调节宫颈癌细胞的增殖、侵袭、迁移、转移和放疗敏感性[3-4]。锌指蛋白反义链1(zinc finger antisense 1，ZFAS1)是lncRNA家族中的一员，是多种肿瘤中的致癌分子，lncRNA ZFAS1通过调控BMI1和ZEB2促进调节骨肉瘤的生长和转移[5]。沉默ZFAS1通过阻断Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌SGC7901细胞的生长、增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化，并增强了对顺铂或紫杉醇的敏感性[6]。miR-193a-3p的异常表达与多种肿瘤的发生发展有关。研究发现miR-193a-3p通过靶向LOXL4基因和氧化应激途径调节膀胱癌的多药耐药性[7]。miR-199a-3p在宫颈癌组织中低表达，而miR-199a-3p对宫颈癌细胞放射敏感性的影响及ZFAS1是否通过miR-199a-3p影响宫颈癌细胞放射敏感性尚不明确[8]。本实验旨在研究ZFAS1对宫颈癌细胞放射敏感性的影响及其机制是否与miR-199a-3p有关，为宫颈癌放射治疗的敏感性提供新思路和新靶点。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1组织来源 收集2015年1月至2019年1月就诊于本院并确诊为宫颈癌的患者134例，放射敏感组为3个月内或局部复发在放疗12个月内未出现局部残留病变的患者；放射抵抗组为原发肿瘤或发生转移不完全消退大于3个月的患者及放射治疗后12个月内原发病灶和转移病灶均有局部复发的患者。两组患者均于放疗后进行手术切除，其中放射敏感组和放射抵抗组各67例。

1.1.2细胞与试剂 宫颈癌细胞Siha购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清、DMEM培养购自美国Gibco公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司；LipofectamineTM2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；双荧光素酶报告实验检测试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙锭(PI)试剂盒、BCA试剂盒、SDS-PAGE试剂盒购自上海碧云天公司；60Co医疗照射装置购自中国核动力研究院。

1.2方法

1.2.1细胞培养 宫颈癌细胞Siha用含10% FBS的DMEM培养基于37℃、5% CO2的恒温箱培养，每2～3 d换液一次，细胞融合至80%左右时进行消化传代。

1.2.2细胞转染和分组 实验分为pcDNA组、pcDNA-ZFAS1组、si-con组、si-ZFAS1组、IR+si-con组、IR+si-ZFAS1组、si-ZFAS1+anti-miR-con组、si-ZFAS1+anti-miR-193a-3p组、IR+si-ZFAS1+anti-miR-con组、IR+si-ZFAS1+anti-miR-193a-3p组。

pcDNA组、pcDNA-ZFAS1组、si-con组、si-ZFAS1组：将pcDNA、pcDNA-ZFAS1、si-con、si-ZFAS1质粒分别转染至Siha细胞；IR+si-con组、IR+si-ZFAS1组：将si-con组、si-ZFAS1组细胞用4 Gy 射线照射；si-ZFAS1+anti-miR-con组、si-ZFAS1+anti-miR-193a-3p组：将anti-miR-con、anti-miR-193a-3p质粒分别与si-ZFAS1共转染至Siha细胞；IR+si-ZFAS1+anti-miR-con组、IR+si-ZFAS1+anti-miR-193a-3p组：将si-ZFAS1+anti-miR-con组、si-ZFAS1+anti-miR-193a-3p组细胞用4 Gy射线照射。

1.2.3qRT-PCR分析miR-193a-3p和lncRNA ZFA-S1表达水平 分别用0、2、4、6、8 Gy的60Co射线照射宫颈癌细胞Siha，继续培养24 h后提取细胞总RNA，反转录试剂盒逆转录为cDNA，按照荧光定量试剂盒说明书进行PCR反应。循环条件为95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环；60℃延长5 min。miR-193a-3p和lncRNA ZFAS1的相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。宫颈癌放射敏感组织和放射抵抗组织及其他各组细胞按上述方法检测miR-193a-3p和ZFAS1表达水平。

1.2.4Western blot检测蛋白表达 收集以上各组细胞提取总蛋白，BCA测定蛋白浓度。蛋白经SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h。分别加入一抗(1∶1 000)4℃孵育过夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，TBST洗涤3次(10 min/次)后于暗室中曝光显影，再浸入定影，最后洗去残液晾干，胶片采用Quantity One凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带的灰度值，以目的条带和β-actin条带的比值作为蛋白相对表达水平。每个蛋白样品重复3次。

1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡 收集以上各组细胞，用不含EDTA的胰酶消化后，PBS漂洗2次，加结合缓冲液重悬细胞。按照试剂盒说明书进行检测，实验重复3次。

1.2.6细胞克隆集落形成实验 取对数生长期si-con组、si-ZFAS1组、si-ZFAS1+anti-miR-con组、si-ZFAS1+anti-miR-193a-3p组细胞，消化后以适中密度接种于直径为60 mm的培养皿，细胞融合达到80%左右，用60Co医疗装置分别给予0、2、4、6、8 Gy 的射线照射。照射后，接种于60 mm培养皿继续培养10～14 d。PBS清洗2遍，甲醇固定15 min，吉姆萨染色30 min，在低倍光学显微镜下计数>50个细胞的集落。克隆形成率(planting efficiency，PE)=克隆数/接种细胞数×100%，存活分数(survival fraction，SF2)=照射剂量组的集落数/(该组细胞接种数×未照射组PE)。采用单击多靶模型拟合细胞存活曲线，SF2=1-(1-e-D/D0)N，Dq=D0×lnN。其中D为照射剂量(Gy)，D0为平均致死剂量，Dq为准阈剂量(代表存活的肩宽度)，N为外推值。放射增敏比(sensitization enhancement ratio，SER)=单纯照射组D0/联合照射组D0。

1.2.7荧光素酶报告基因检测实验检测ZFAS1对miR-193a-3p的靶向调控 Starbase预测显示ZFAS1与miR-7-5p存在结合位点。构建野生型和突变型基因靶点ZFAS1的荧光素酶表达载体(WT-ZFAS1和MUT-ZFAS1)，用Primer 3.0设计引物序列，WT-ZFAS1 F：5′-CCGCTCGAGTACACTATTGGCCAGTT-3′，R：5′-GAATGCGGCCGCTGAAGTGGGCACAGCC-TTTTA-3′；MUT-ZFAS1 F：5′-CCGCTCGAGTACACTATTCCGGTCAT-3′，R：5′-GAATGCGGCCGCTGAA-GTGGGCACAGCCTTTTA-3′。加粗的分别为XhoⅠ，NotⅠ酶切位点序列，之前为保护碱基，进行PCR扩增，反应体系为30 μl，扩增条件为95℃预变性5 min 进入扩增循环，循环条件为94℃ 1 min，60℃ 30 s；72℃ 45 s，共40个循环；72℃延长5 min。产物经电泳后切胶回收，回收的PCR产物和pmir-RB-REPORTTM载体分别用XhoⅠ，NotⅠ进行双酶切，然后连接PCR产物与载体，产物与载体比例为3∶1，连接反应产物转化100 μl大肠杆菌感受态DH5α，将用XhoⅠ和NotⅠ双酶切正确的产物重组载体送测，测序正确的用于实验。取对数生长期Siha细胞接种于24孔板(1×103个/孔)，待细胞生长至80%融合时，用LipofectamineTM2000将miR-con和miR-193a-3p的质粒分别与WT-ZFAS1和MUT-ZFAS1共转染至Siha细胞，按说明书进行操作，检测细胞荧光素酶活性。

2 结果

2.1宫颈癌细胞组织和Siha中lncRNA ZFAS1和miR-193a-3p的表达 与放射敏感组织相比，放射抵抗组织中ZFAS1表达水平显著升高，miR-193a-3p表达水平显著降低(P<0.05)；不同辐射剂量照射宫颈癌细胞Siha后，ZFAS1表达水平显著升高，miR-193a-3p表达水平显著降低(P<0.05，图1)。

2.2沉默lncRNA ZFAS1促进宫颈癌细胞Siha凋亡 沉默ZFAS1及ZFAS1联合4 Gy射线照射后，ZFAS1表达水平显著降低，Cleaved Caspase-3表达水平显著升高，Cyclin D1表达水平显著降低，细胞凋亡率显著升高(P<0.05，图2)。表明沉默ZFAS1联合4 Gy射线可促进细胞凋亡。

2.3沉默ZFAS1增加宫颈癌细胞Siha放射敏感性 单击多靶模型拟合计算得出，si-con组和si-ZFAS1组的D0值分别为2.50和1.69，si-ZFAS1组放射增敏比为1.48(表1)；在同一剂量照射下，si-ZFAS1照射组的细胞克隆形成数及存活分数明显低于si-con照射组；沉默ZFAS1及ZFAS1联合4 Gy射线照射后，Siha中γ-H2AX表达水平显著升高(P<0.05，图3)。提示沉默ZFAS1可增加宫颈癌细胞Siha的放射敏感性。

2.4lncRNA ZFAS1靶向miR-193a-3p Startbase数据库预测显示ZFAS1与miR-193a-3p存在结合位点(图4A)；相较于miR-con组，miR-193a-3p组转染WT-ZFAS1载体的宫颈癌细胞Siha的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；而转染MUT-ZFAS1载体的宫颈癌细胞Siha的荧光素酶活性差异无统计学意义(图4B)。相较于si-con组，si-ZFAS1组Siha细胞中miR-193a-3p的表达水平显著升高；相较于pcDNA组，pcDNA-ZFAS1组Siha细胞中miR-193a-3p表达水平显著降低(P<0.05，图4C)。提示ZFAS1可靶向调控miR-193a-3p表达。

图1 宫颈癌组织和Siha细胞中lncRNA ZFAS1和miR-193a-3p的表达水平Fig.1 Expressions of lncRNA ZFAS1 and miR-193a-3p in cervical cancer tissue and Siha cellNote:Compared with radiosensitive tissue,*.P<0.05 ;compared with 0 Gy group,#.P<0.05.

图2 沉默lncRNA ZFAS1对宫颈癌细胞Siha凋亡及相关蛋白的影响Fig.2 Effect of silencing lncRNA ZFAS1 on apoptosis and related proteins in cervical cancer cell SihaNote:1.si-con;2.si-ZFAS1;3.IR-si-con;4.IR+si-ZFAS1.*.P<0.05 vs si-con group；#.P<0.05 vs IR+si-con group.

2.5抑制miR-193a-3p表达逆转对沉默ZFAS1对宫颈癌细胞Siha的抑制作用 沉默ZFAS1联合4 Gy射线照射后Siha中miR-193a-3p、Cleaved Caspase-3、γ-H2AX表达水平显著升高，Cyclin D1表达水平显著降低，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；沉默ZFAS1和miR-193a-3p及联合4 Gy射线照射后，Siha中miR-193a-3p、Cleaved Caspase-3、γ-H2AX表达水平显著降低，Cyclin D1表达水平显著升高，细胞凋亡率显著降低(P<0.05，图5)。提示抑制miR-193a-3p表达逆转对沉默lncRNA ZFAS1对宫颈癌细胞Siha的凋亡促进作用。

表1 沉默lncRNA ZFAS1对宫颈癌细胞Siha放射后单击多靶模型拟合的参数值

图3 不同剂量下宫颈癌细胞Siha存活曲线和4 Gy剂量下γ-H2AX蛋白表达

单击多靶模型拟合计算显示(表2)，si-ZFAS1组和si-ZFAS1+ anti-miR-193a-3p组的放射增敏比分别为1.34和0.79；在同一剂量照射下，IR+si-ZFAS1组的存活率明显低于IR+si-con组，而IR+si-ZFAS1+anti-miR-193a-3p 组存活率明显高于IR+si-ZFAS1+anti-miR-con组。提示抑制miR-193a-3p表达可逆转对沉默ZFAS1对宫颈癌细胞Siha的放射增敏作用。

图4 lncRNA ZFAS1与miR-193a-3p的靶向关系Fig.4 Targeting relationship between lncRNA ZFAS1 and miR-193a-3pNote:*.P<0.05 vs miR-con group；Δ.P<0.05 vs si-con group；#.P<0.05 vs pcDNA group.

图5 宫颈癌细胞Siha存活曲线、凋亡率及Caspase-3、Cyclin D1、γ-H2AX蛋白的表达

表2 沉默ZFAS1对宫颈癌细胞Siha放射后单击多靶模型拟合的参数值

3 讨论

放疗广泛应用于宫颈癌的临床治疗，使部分患者得到了较好的治疗，但辐射抗性的出现使宫颈癌患者放疗后出现复发和转移，逆转宫颈癌辐射抵抗、提高肿瘤治愈率是目前临床亟待解决的难题[9]。研究表明，在多种肿瘤放射治疗前后，部分lncRNA异常表达，可能通过调控细胞周期影响肿瘤细胞的放疗敏感性[10]。ZFAS1是一种新的肿瘤相关的lncRNA，敲除ZFAS1可以增强非小细胞肺癌细胞对新型分子靶向药物安罗替尼的敏感性[11-12]。ZFAS1还与卵巢癌患者的铂类化疗敏感性相关[13]。ZFAS1过表达通过引起细胞周期停滞和诱导乳腺癌细胞凋亡而显著抑制细胞增殖[14]。本实验结果显示，宫颈癌放射抵抗组织和不同剂量射线照射后的宫颈癌细胞中ZFAS1高表达，沉默ZFAS1促进宫颈癌细胞凋亡并增加细胞放射敏感性。H2AX是组蛋白H2A家族成员之一，可作为电离辐射后DNA双链断裂损伤的标志，其表达量的变化可反应细胞的放射敏感性[15]。而Cleaved Caspase-3是细胞凋亡调控蛋白，其高表达促进细胞凋亡，Cyclin D1则通过阻滞细胞周期抑制细胞增殖。本实验结果显示沉默ZFAS1促进Cleaved Caspase-3、γ-H2AX表达，抑制Cyclin D1表达。进一步说明沉默ZFAS1促进宫颈癌细胞凋亡，增强其放射敏感性。

有研究显示，miR-193a-3p通过抑制Cyclin D1表达将细胞周期阻滞在G1期，进而抑制细胞增殖[16]。本实验中抑制miR-193a-3p逆转了沉默ZFAS1对Cyclin D1表达的抑制作用，提示其可促进肿瘤细胞增殖。此外，研究发现miR-193a-3p是非小细胞肺癌放疗敏感性相关的miRNA之一[17]。miR-193a-3p在食管癌放射耐受细胞中高表达，抑制其表达细胞放射敏感性增加，促进放射耐受细胞凋亡[18]。miR-193a-3p在肺癌中发挥肿瘤抑制剂的作用，miR-193a-3p通过调控下游基因ERBB4增加肺癌细胞放射敏感性[19]；miR-193a-3p在多药耐受细胞SKOV-3中高表达，参与调节卵巢癌细胞多药耐受[20]。本实验结果显示，miR-193a-3p在放射抵抗宫颈癌组织和射线照射的宫颈癌细胞中低表达，抑制miR-193a-3p表达逆转了沉默ZFAS1对宫颈癌细胞的放射增敏和细胞凋亡促进作用，且ZFAS1靶向调节miR-193a-3p表达。说明lncRNA ZFAS1可能通过控miR-193a-3p影响宫颈癌细胞的放射敏感性。

综上所述，lncRNA ZFAS1可增加宫颈癌细胞的放射敏感性并促细胞凋亡，其机制可能与调控miR-193a-3p有关，可为宫颈癌的放疗提供新靶点和新思路。