精索静脉曲张不育患者各项精液分析指标的特征及其临床价值*

王希部，罗燕萍，刘丽亚，莫红梅

广东省深圳市罗湖区人民医院医学检验科，广东深圳 518000

精索静脉曲张临床定义为精索脐带状丛中静脉异常扩张和弯曲，是男性不育的常见原因之一。有研究表明，近40%的男性不育由精索静脉曲张导致[1]。精索静脉曲张的发生机制由多因素导致，其中氧化应激为核心机制。精子的DNA和脂质膜直接受到活性氧族(ROS)的攻击，导致精子DNA损伤，引起精子DNA碎片增加。因此，精子DNA完整性检测是反映精子DNA损伤程度的一项重要指标，精子DNA损伤可以使男性不育。另外，氧化应激可影响精子核酸结构和功能，致使精子蛋白氧化，损伤睾丸，同时，通过氧化细胞膜诱发生精细胞凋亡，从而导致精子形态、运动性和受精能力的改变。本研究拟通过分析精索静脉曲张不育患者和健康婚育检查人士精子DNA完整性和精液常规参数分析指标之间的关系，用多参数联合检测旨在为精索静脉曲张患者不育中的筛查和治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性选择本院2019年确诊的107例精索静脉曲张，并同时检查精子DNA完整性和精液常规参数、精子形态的不育患者纳入精索静脉曲张组。精索静脉曲张以B超诊断为金标准，其中1级精索静脉曲张82例，2级精索静脉曲张15例，3级精索静脉曲张10例；平均年龄为(32.0±6.1)岁。再选择同期健康婚育检查人士60例作为健康对照组，平均年龄为(33.5±6.9)岁。两组间年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2仪器与试剂 仪器：上海北昂BEION S3精液分析仪与配套计数池，迈瑞BriCyte E6流式细胞仪。试剂：贝索精子形态学快速染色液，包括固定剂(Diff-Quick Fix)、染液Ⅰ(Diff-Quick Ⅰ)、染液Ⅱ(Diff-Quick Ⅱ)；浙江星博生物科技股份有限公司精子DNA完整性检测试剂盒，医疗器械注册证号为浙甬食药监械(准)字2012第1400127号，试剂规格为10人份/盒，试剂由A、B、C1和C2液4部分组成。

1.3方法

1.3.1精液标本的采集及处理 所有研究对象禁欲3～7 d，手淫法取出精液放置于无菌杯中，并记录取精时间和禁欲天数，立即送检。收到标本置于37 ℃水浴箱中孵育，待精液完全液化，利用计算机辅助精子分析系统进行各项精液常规参数分析，使用“拉薄”技术进行精子形态学分析，留取0.5 mL精液用于精子DNA完整性分析。若精子DNA完整性不能及时检测，放置于—20 ℃冰箱进行保存，1周内进行检测。

1.3.2精液常规参数分析 使用上海北昂BEION S3精液分析仪及配套计数池，按照仪器标准操作规程，待标本完全液化后混匀，吸取液化精液5 μL，冲池放入计数池，样品自行扩散充满仓室内部，再静置1 min进行检测，通过显微图像采集系统将精子图像放大,并将结果输入计算机，同时显示在屏幕上，在计算机软件控制下，全自动显微镜自动扫描显微镜下的精子图像，并记录精子的运动轨迹，通过软件分析，计算标本的精子浓度、存活率及活力级别、前向活动力精子(PR)等各项参数。

1.3.3精子形态学分析 严格按照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》，取液化后混匀的精液(5～10 μL)，使用“拉薄”技术，制成适当厚度涂片，待自然干燥后第2天，使用贝索精子形态学快速染色液(Diff-Quick法)，按照说明书对精子进行染色，油镜计数200个精子，记录正常精子数、头部缺陷精子数、中段缺陷精子数、尾部缺陷精子数，由此计算出正常精子百分比(PNS)、畸形精子指数(TZI)、精子畸形指数(SDI)。

1.3.4精子DNA完整性检测 正常精子DNA紧密结合，且具有抗酸性，维持双链的稳定性，而受损的或不成熟的精子形成松散的染色质结构，其DNA在酸作用下变成单链，吖啶橙(AO)与双链DNA结合发出绿色荧光，与单链DNA结合发出红色荧光。采用精子染色质结构分析法，使用浙江星博生物科技股份有限公司精子DNA完整性检测试剂盒进行检测，严格按照说明书操作，每管按计算取样量加入精子标本，再加入A液至100 μL，冰上充分混匀，加入B液 200 μL，准确计时30 s，再加入染色液(C1+C2液配制而成)600 μL，冰上静置1 min后立即使用迈瑞流式细胞仪进行检测，流式检测速度大约为每秒200～300个，以收集5 000个粒子数为结束条件。将流式细胞仪检测完毕的文件导出，采用专用软件进行处理，计数得出精子DNA碎片指数(DFI)和高DNA可染性(HDS)。

2 结 果

2.1两组各项精液分析指标结果比较 精索静脉曲张组和健康对照组各项精液分析指标比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组各项精液分析指标结果比较

2.2精子DFI与其他精液分析指标的相关性分析 精子DFI与HDS、TZI、SDI呈正相关(r=0.530、0.454、0.306，P<0.05)，与PR、PNS呈负相关(r=—0.559、—0.245，P<0.05)，与精子浓度无明显相关性(r=—0.112，P>0.05)。

2.3多因素Logistic回归分析 精子DFI、HDS是精索静脉曲张不育的独立危险因素(P<0.05)，见表2。

表2 多因素Logistic回归分析

2.4各项精液分析指标和联合检测对精索静脉曲张不育的诊断价值 联合检测的诊断效果明显优于单独检测。单独检测中，以精子DFI诊断效能最佳。见表3、图1。

图1 各项指标联合检测与单独检测诊断精索静脉曲张不育的ROC曲线

表3 各项精液分析指标及联合检测对精索静脉曲张不育的诊断价值

3 讨 论

精索静脉曲张是影响生育能力的重要因素之一，其导致男性不育的机制仍未完全阐明。精索静脉曲张导致男性不育的因素有氧化应激、精子DNA损伤、睾丸缺氧、局部高温、肾脏及肾上腺代谢物质的反流、一氧化氮、免疫因素等，其中氧化应激是临床公认的一个关键重要机制，此学说通过分子机制阐述了精索静脉曲张会引起精液质量的下降和精子DNA的损伤。而精子DNA的损伤又会负反馈地促进更多的ROS产生，引起恶性循环[2]。本研究结果显示，与健康婚育检查人士相比，精索静脉曲张不育患者的精子浓度、PR、PNS均降低，而精子DFI、HDS、TZI、SDI均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。本研究结果与钟慧芝等[3]的研究一致，这说明精索静脉曲张不育患者生成的精液质量较差，生育能力下降，也印证了氧化应激的分子机制学说。

精子遗传信息的载体主要是头部的DNA和中部线粒体DNA。精子DNA的损伤主要由细胞凋亡、ROS的影响、染色质的异常所导致[4]。刘利敏等[5]研究发现，ROS结果与精子DFI呈正相关，ROS的增加会导致氧化应激的发生。有研究表明，氧化应激是导致精索静脉曲张发生的因素之一[6]。本研究通过多因素Logistic回归分析显示，精子DFI和HDS是精索静脉曲张不育的独立危险因素。这说明精子DNA完整性与精索静脉曲张具有密切的关系，精索静脉曲张会损伤精子DNA，引起精子染色质异常。通过筛查精子DNA完整性，可以对男性的生育能力进行评估，同时进一步印证了上面的分子机制学说。

精子DNA完整性的检测在生殖医学中极其重要，关于精子DFI与精液常规参数分析、精子形态学分析的各指标相关性已有较多报道，但关于联合相关参数在精索静脉曲张不育患者中的诊断效能的研究相对较少。本研究结果显示，精子DFI与HDS、TZI、SDI呈正相关(r=0.530、0.454、0.306，P<0.05)，与PR、PNS呈负相关(r=—0.559、—0.245，P<0.05)，与精子浓度无明显相关性(r=—0.112，P>0.05)。除精子浓度外，与曾兰等[7]研究结果一致，而精子浓度结果与李非凡等[8]研究结果一致。精子DFI、HDS、PR、精子浓度、PNS、TZI、SDI多参数联合检测诊断精索静脉曲张不育的AUC为0.871(95%CI：0.819～0.924，P<0.05)，灵敏度为71.0%，特异度为95.0%，阳性预测值为95.0%，阴性预测值为65.5%，约登指数为0.660，诊断效能最高。联合检测的特异度高达95.0%，与B超诊断的特异度基本一致[9]。提示联合检测优于单独检测的诊断效能。单个项目中，精子DFI和HDS诊断精索静脉曲张不育患者效能较高，其次为TZI和SDI，其他参数诊断效能较低，不能用于男性生育能力的评估和判断患者预后，这与COCUZZA等[10]研究一致，说明精子DNA完整性与精索静脉曲张不育关系密切。

精子DNA完整性与精液常规参数分析项目具有关联性，可以作为精索静脉曲张不育的临床筛查指标，而精子DNA完整性联合精液常规参数分析能够为精索静脉曲张不育提供更为准确的诊断，可以更好地为临床提供帮助，建议将联合检测作为常规检测。