芪丹利心丸减轻心肌梗死大鼠心肌凋亡的机制研究

刘珂珂，王 帅，吴爱明，侯雅竹，娄利霞，吕 梦，张冬梅，商洪才

心肌梗死可导致进行性心脏功能障碍甚至心力衰竭，具有较高的发病率和死亡率。在这一病理过程中，心肌细胞凋亡扮演了重要角色，其可在一定程度上决定梗死范围的大小，进而影响疾病的进展[1]。细胞凋亡又称程序性死亡，是一种严格受控的细胞自杀模式。凋亡能清除衰老及异常细胞，从而维持内环境的稳定，但心肌梗死后过度凋亡往往导致心肌细胞大量减少，心功能严重受损。抑制心肌细胞凋亡，可减轻心肌梗死后的心肌损伤，是防治心肌梗死的一种可行策略。

转化生长因子-β(transforming growth factor-β， TGF-β)可以参与调控细胞生长、分化、凋亡等生物学过程。研究表明，TGF-β主要有3种亚型，它们在心肌梗死后受损心肌组织的愈合、修复过程中表达均上调[2]。TGF-β1和TGF-β2在心肌梗死早期即出现上调，而TGF-β3则是迟发及长时效上调[3]。其中，TGF-β1与凋亡的关系最为密切[4-7]，可通过TGF-β1/Smads信号通路参与细胞凋亡等多种过程，从而影响心肌梗死的转归。芪丹利心丸是天津中医药大学第一附属医院心内科的专利方，由黄芪、党参、刺五加、丹参、葶苈子等组成，具有益气活血利水之功。研究发现，芪丹利心丸治疗心肌梗死的机制可能与TGF-β1/Smads信号通路有关[8]。据此推测芪丹利心丸可能会对心肌梗死后的心肌细胞凋亡产生积极治疗作用。因此，本研究从凋亡通路角度研究芪丹利心丸治疗心肌梗死的疗效及机制，为其临床应用提供更多的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠，健康无特定病原体(SPF)级，体质量(180±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2012-0001。

1.2 主要试剂与药品 戊巴比妥钠(北京化学试剂公司，货号：C06818794)；苏木精伊红(HE)染色液(南京建成科技有限公司，货号：D006)；TGF-β (Abcam公司，货号：ab92486)；Smad 2、Smad 3(Abcam公司，货号：ab40855、ab40854)；Bcl-2、Bax(Proteintech公司，货号：26593-1-Ap、60267-1-Ig)；Caspase-3、Caspase-9 (Abcam公司，货号：ab184787、ab184786)；凋亡检测试剂盒(Promega公司，货号：G3250)。芪丹利心丸由天津中医药大学第一附属医院提供(专利号：ZL 201110413471.1)；卡托普利片(每片12.5 mg)由中美上海施贵宝制药有限公司提供(批号：AAN9869)。

1.3 动物模型制备 参照文献[9]建立心肌梗死大鼠模型，使用1%戊巴比妥钠0.5 mL/100 g腹腔注射麻醉后经喉气管插管，心前区第3肋、第4肋间横向开胸，在肺动脉圆锥与左心耳下约1 mm处用5/0手术线结扎左冠状动脉前降支，见到心前区缺血变白且心电图ST段抬高，即逐层缝合关胸，术后24 h不符合心肌梗死心电图特征的动物予以剔除。假手术组操作同模型组，但只穿线不结扎。

1.4 分组给药 将造模术后大鼠随机分为假手术组、模型组、卡托普利组、芪丹利心丸组。芪丹利心丸组与卡托普利组参照文献[10]进行等效剂量换算，相当于成人临床用量的等效剂量。术后第2天开始，根据分组情况分别给予芪丹利心丸2.43 g/(kg·d)、卡托普利片2.25 mg/(kg·d)，假手术组和模型组给予等体积去离子水，连续灌胃4周。治疗结束后每组各剩余10只动物。

1.5 HE染色 心肌组织经4%的多聚甲醛固定24 h，然后修剪、石蜡包埋、切片、烤片。常规脱蜡水化后，切片入苏木素染3～8 min，自来水冲洗，光镜下观察，1%的盐酸乙醇分化数秒，自来水冲洗返蓝。接着切片入伊红染液中染色1～3 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察拍照。

1.6 蛋白质印迹法(Western Blot)检测凋亡相关通路蛋白的表达 采用RIPA蛋白裂解法蛋白提取试剂盒提取左心室心肌组织中的总蛋白，冰上裂解45 min，间隔混匀组织液，裂解完成后于4 ℃12 000 g离心25 min，收集上清液，取样稀释，采用BCA法测定蛋白浓度，根据测定结果调整所有蛋白样本使其为相同浓度。SDS-PAGE电泳分离，湿转转移至硝酸纤维膜上，用5%的脱脂奶粉常温摇床封闭1 h，加入预先按说明书稀释好的一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后加对应的二抗室温孵育1 h，以GAPDH为内参，TBST清洗后ECL显色曝光得到蛋白条带，并使用Image J软件进行条带分析。

1.7 原位末端标记测定(TUNEL)法检测细胞凋亡 TUNEL染色按照试剂盒说明书进行，充分脱蜡、水化后，室温平衡10 min，冰上配制反应液，37 ℃孵育60 min，终止并用PBS溶液冲洗以去除未加入的荧光素-12-dUTP，在心肌组织上滴一滴含DAPI的抗荧光衰减封片剂，用盖玻片盖住玻片并用透明甲油封住边缘。立即在荧光显微镜(A1，ZEISS，德国)下进行图像采集，设置标准荧光素滤光片，观察荧光素在520 nm处表示凋亡核的绿色荧光以及在460 nm处蓝色的全核。用Image-Pro Plus 6.0软件计数凋亡细胞核和正常细胞核的数目，计算凋亡指数。

2 结 果

2.1 各组大鼠HE染色结果 假手术组心肌纤维排列整齐，染色均匀，细胞核大小形态基本一致；模型组心肌纤维排列紊乱，局部肌纤维断裂；与模型组相比，各给药组均在一定程度上得到改善，心肌纤维排列相对整齐。详见图1。

图1 各组大鼠HE染色结果(×400)

2.2 各组大鼠TGF-β1/Smads通路蛋白表达的比较 与假手术组比较，模型组TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表达升高(P<0.05)；与模型组比较，芪丹利心丸组和卡托普利组TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表达降低(P<0.05)。详见图2。

2.3 各组大鼠凋亡相关蛋白表达的比较 与假手术组比较，模型组大鼠的Bcl-2表达降低(P<0.01)，Bax表达升高(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)；与模型组比较，芪丹利心丸组与卡托普利组Bcl-2表达增加(P<0.05)，Bax表达减少(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值增加(P<0.05)。在Caspase凋亡蛋白表达方面，与假手术组比较，模型组Caspase-9和Caspase-3表达均增加(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较，芪丹利心丸组Caspase-9和Caspase-3表达均降低(P<0.05或P<0.01)，卡托普利组Caspase-9表达降低(P<0.01)，Caspase-3表达虽有降低趋势，但无统计学意义。详见图3。

与假手术组比较，＊ P<0.05，＊＊ P<0.01；与模型组比较，# P<0.05，## P<0.01。图3 各组大鼠凋亡相关蛋白表达的比较(n=3)

2.4 各组大鼠心肌细胞凋亡的比较 与假手术组比较，模型组心肌细胞凋亡指数增高(P<0.05)；与模型组比较，芪丹利心丸组和卡托普利组心肌细胞凋亡指数降低(P<0.05)。详见图4。

与假手术组比较，＊ P<0.05；与模型组比较，# P<0.05。图4 各组大鼠心肌细胞凋亡的比较(n=10)

3 讨 论

心肌梗死是严重的心血管疾病，在全球范围内呈现较高的发病率和死亡率[11-12]。心肌梗死后梗死周围心肌细胞发生凋亡或坏死，导致局部心肌细胞数目大量减少，临床表现为进行性心功能下降甚至心力衰竭。有研究表明，凋亡细胞占梗死区所有丢失细胞的86%，表明其是导致心肌细胞丢失的主要原因[13]。而心肌细胞数量与心功能密切相关，因此，抑制心肌细胞凋亡对于提高心肌梗死病人的心功能及改善预后意义重大[14-15]。

中医药在防治心肌梗死方面有着确切的临床疗效[15-16]，其机制与减轻心肌细胞凋亡密不可分[17-18]。芪丹利心丸是依据益气活血利水治则创制的专利方，近期文献报道，其能够调控TGF-β1的表达继而改善心肌梗死后的心肌纤维化[8，19]。目前研究认为，TGF-β1的作用十分广泛，除调控纤维化以外，也参与了凋亡过程，可通过TGF-β1/Smads信号通路导致凋亡的激活[4-7]。因此，芪丹利心丸对心肌细胞凋亡的影响和机制值得进一步研究。

本研究结果表明，心肌梗死大鼠TGF-β1/Smads信号通路发生了过度激活，芪丹利心丸能够降低TGF-β1及下游Smad 2、Smad 3的表达，这与文献报道[8，19]一致。本研究在此基础上进一步观察了芪丹利心丸对凋亡通路中Bcl-2、Bax以及Caspase蛋白表达的影响。研究结果表明，心肌梗死大鼠Bcl-2蛋白表达减少而Bax蛋白表达增加，并且Bcl-2/Bax比值减小，而芪丹利心丸可显著改善Bcl-2和Bax蛋白的异常表达。对于细胞凋亡，可看作是一个由Bcl-2家族和Caspase家族蛋白质执行程序化、规范化命令的过程，Bcl-2、Bax以及Caspase蛋白在其中发挥了重要作用[20-22]。Bcl-2蛋白作为Bcl-2家族中的保护性蛋白，广泛存在于核膜外、内质网膜及线粒体内膜而抑制凋亡的发生，Bax蛋白作为Bcl-2蛋白同源体可促进凋亡的发生。Bcl-2和Bax的比值直接决定了线粒体外膜各种通道的开放程度，使其通透性发生改变，引起细胞色素C的释放，进而导致Caspase通路的活化和凋亡的发生。本研究结果表明，心肌梗死后Caspase-9和Caspase-3表达增加。Caspase-9和Caspase-3是Caspase家族中的关键蛋白，心肌缺血后，细胞色素C从线粒体内释放到胞浆与Apaf-1结合，募集并激活Caspase-9，进而激活下游的Caspase-3，启动凋亡程序[20]。因此，心肌梗死大鼠的心肌细胞凋亡指数明显增加。本研究中芪丹利心丸可降低Caspase-9、Caspase-3蛋白的表达，减少心肌细胞凋亡。

综上所述，本研究表明芪丹利心丸能够减轻心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡，其机制与调节TGF-β1/Smads信号通路，改善Bcl-2、Bax及Caspase蛋白表达有关。