金花茶组叶片生化成分评价及其最佳采收期研究

刘保财 陈菁瑛 张武君 黄颖桢 赵云青

摘  要：本研究以26份来源于6种金花茶组植物、不同表型防城金花茶和不同月份采收的防城金花茶的成熟叶片为材料，建立同时测定芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚4种黄酮成分的HPLC法，以及优化了测定茶多酚、总黄酮、总多糖和总皂苷成分含量的紫外分光光度法，基于以上8种成分含量，结合主成分综合评分和聚类分析的化学计量学方法，对不同来源金花茶叶片生化成分进行综合评价。结果表明：8种成分含量在不同来源金花茶叶片中存在差异，其中无名金花茶8种成分含量均较高，四季金花茶、防城金花茶次之;8年生1—12月份采收的防城金花茶叶片中，总皂苷、总黄酮和总多糖含量均表现为升-降-升-降的变化规律，并在10月含量达到最高;5年生不同种（S1～S14）主成分综合评分顺序为：无名金花茶>四季金花茶>防城金花茶（花蕾大、花多、不抗寒、花黄且大、尖果）>显脉金花茶>凹脉金花茶>小果金花茶;8年生不同月份（S15～S26）主成分综合评分顺序为：10月采>2月采>3月采>4月采>5月采>7月采>6月采>1月采>8月采>12月采>11月采>9月采，其中無名金花茶、四季金花茶及防城金花茶中花蕾大、花多、花黄且大等表型的金花茶叶片与2—4月份和10月份采集的8年生金花茶叶片的多指标综合评分排序位列前10;聚类分析结果将供试26份样品分为5类。综上所述，金花茶叶片的生化成分与金花茶植物种类和采收期有关，无名金花茶、四季金花茶和防城金花茶中花蕾大、花多、不抗寒、花黄且大的表现型的综合生化成分较高，初步确定防城金花茶叶片的适宜采收期为2—4月份和10月份，所建立的多指标定量结合化学计量学分析方法为金花茶组植物叶片的生化成分评价提供依据。

关键词：金花茶组;多成分测定;化学计量学;品质评价;采收期

中图分类号：S432.2      文献标识码：A

Abstract： 26 accessions including six species of golden camellia， different phenotypes of Camellia chrysantha and C. chrysantha collected in different months were selected as the research materials. The simultaneous determination of rutin， quercetin， luteolin and kaempferiae by HPLC and the determination of tea polyphenols， flavonoids， total polysaccharides and total saponins by ultraviolet spectrophotometric were established and optimized. The quality of leaves of golden camellia from different sources was comprehensively evaluated based on the combination of the principal component comprehensive scores and clustering analysis of the eight biochemical components. There were differences in the content of the eight components in different sources. The content of the eight components in C. nitidissima was higher， followed by that of C. perpetua and C. chrysantha. The content of total saponins， total flavonoids and total polysaccharides in 8-year-old C. chrysantha collected from January to December all showed the rule of ascending-descending-ascending-descending， and reached the highest value in October. The order of the principal component comprehensive score of the 5-year-old different species （S1-S14） was as follows： C. nitidissima > C. perpetua > C. chrysantha （large flowers， many flowers， not cold-resistant， yellow flowers and large， sharp fruits） > C. euphlebi > C. impressinervis > C.nitidissima var. microcarpa. The order of the comprehensive scores of the main ingredients of the 8-year-old havested in different months （S15-S26） was October > February > March > April > May > July > June > January > August > December > November > September. Besides， the ranking of the comprehensive scores of large buds， large flowers， multi-golden flower and February to April and October harvested C. chrysantha was higher and at the first 10 ranks. Cluster analysis classified the 26 accessions could be classified into five categories. In summary， the quality of golden camellia was affected by variety， tree age and harvest time. The comprehensive biochemical compositions of C. nitidissima， C. perpetua and C. chrysantha with phenotype of large flower buds， many flowers， not cold resisdence， yellow and big flowers was better. It approved that the best harvest period of C. chrysantha was from February to April and October. The established multi-index quantitative analysis combined with chemometric analysis would provide a reference for biochemical evaluation of golden camellia.

Keywords： Camellia Sect. Chrysantha; simultaneous determination; chemometrics methods; quantitative evaluation; harvest period

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.022

金花茶组（Camellia Sect. Chrysantha Chang）属山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia L.）植物[1]，早在李时珍《本草纲目》有载“山茶产南方……或亦云有黄色者”[2]，是茶花家族中唯一花瓣金黄色的珍稀物种，享有“茶族皇后”“植物界大熊猫”的美誉，含有黄酮类、多糖、茶多酚、皂苷等多种生理活性成分和氨基酸、蛋白质等营养成分[3]，具有清热解毒、利尿消肿、止痢等功效[4-6]，其叶和花是广西壮族传统民间用药，具有食用、观赏和药用的多重价值[7-9]。

目前已发现全世界分布的金花茶组植物有42种5个变种，而我国有29种5个变种[10]，主要分布在北回归线以南，北纬21°30～22°55、东经107°36～108°33的广西南部和西南部防城、南宁、东兴等地区[11-14]。自1978年开始，福建福州、福建龙岩、湖南长沙、浙江温州等地均开展金花茶的引种和推广[15]，已有学者对金花茶组植物驯化栽培、优良品种选育和品质评价等展开研究[4-8， 16-18]，对其研究主要集中在生物学特征评价、总黄酮、茶多酚等多成分含量测定，有研究表明芦丁、槲皮素、木犀草素和山奈酚是其主要黄酮类成分，也是主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌等作用[8]。迄今有关金花茶叶片综合评价及适宜采收期的研究尚未见报道，因此本研究基于前人对金花茶叶化学成分的报道，以不同种源、同种不同表型和同一表型不同采收期的金花茶成熟叶片为研究对象，把总黄酮、总多糖、总皂苷、茶多酚及芦丁、槲皮素、木犀草素和山奈酚等主要黄酮成分作为综合指标，建立多成分指标结合主成分分析、聚类分析的化学计量学的综合评价方法评价金花茶叶片，为全面、客观地评价金花茶叶片品质和适宜采收期提供参考。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  材料与试剂  5年生不同种源金花茶成熟叶片（编号S1～S6）于2017年5月18日采于福建省漳平市展宏金花茶专业合作社;5年生不同表型防城金花茶（Camellia chrysantha）成熟叶片（编号S7～S14）于2017年5月18日采于福建省漳平市展宏金花茶专业合作社;8年生防城金花茶不同月龄的成熟叶片（编号S15～S26）于2017年1—12月每月10日采于福建省世纪金花科技有限公司金花茶基地。所有样品经福建省龙岩林业种苗站洪永辉教授级高工鉴定，留样保存于福建省农业科学院药用植物研究中心，样品信息见表1。

对照品芦丁（批號：100080-201409，91.9%）、木犀草素（批号：111520-201605，99.6%）购自中国食品药品检定研究院;槲皮素（批号：100081-200406，98%）购自中国药品生物制品检定所;山奈酚（批号：10051321，98%）购自上海同田生物科技有限公司。甲醇（德国Merck公司）、磷酸为色谱纯（阿拉丁），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.1.2  仪器与设备  Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent technologies公司）;KQ-400DE超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）;UV1600紫外可见分光系统（天津市拓普仪器有限公司）;R-210旋转蒸发仪、B-491水浴锅（瑞士Buchi公司）;予华SHZ-D循环水式真空泵（巩义市予华仪器厂）;BP210十万分之一天平（德国Sartorius公司）;JSP-200高速多功能粉碎机（浙江省永康市金穗机械制造厂）;Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）;Fd-1a-50真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）。

1.2  方法

1.2.1  样品前处理  金花茶成熟叶片经冷冻干燥，粉碎后，过40目筛得样品粉末，备用。

1.2.2  HPLC法测定金花茶叶中芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量  （1）色谱条件。采用Ultimate XB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，3 μm），流动相为甲醇（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脱（0～20 min，35%～35% A;20～30 min，35%～55% A;30～50 min，55%～55% A），流速0.8 mL/min，检测波长为360 nm，柱温35 ℃，进样量10 μL。（2）对照品溶液制备。分别精密称取对照品芦丁6.6 mg、槲皮素1.7 mg、木犀草素1.6 mg、山奈酚1.9 mg，分别加入甲醇并定容于10 mL量瓶中，作为对照品贮备液。分别吸取2、1、1、2 mL于25 mL量瓶中，并加入甲醇定容至25 mL，即得芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚质量浓度分别为52.8、6.8、6.4、15.2 μg/mL的混合对照品贮备液，备用。

1.2.3  UV法测定金花茶叶茶多酚、总黄酮、总多糖、总皂苷含量  茶多酚测定参照《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》（GB/T 8313— 2008）[19]，得到茶多酚待测液（Ⅰ），按福林酚氧化法测定。

总黄酮的测定参考黄兴贤等[20]、韦秀芝等[21]的方法，并稍作修改后得提取流程：称取0.5 g样品粉末于50 mL锥形瓶中，加75%乙醇40 mL，20 ℃下超声提取0.5 h，过滤，用75%乙醇洗涤残渣，合并滤液定容于50 mL容量瓶中，得总黄酮待测液（Ⅱ），按亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法[21]测定。

总多糖测定参考韦璐等[22]的方法，稍作修改，在提取总黄酮后，将残渣加45 mL水于75 ℃超声提取1 h，过滤，用水洗涤滤渣，合并滤液定容于50 mL容量瓶中，得多糖待测液（Ⅲ），按苯酚-硫酸法[23]测定。

总皂苷测定参考高丽萍等[24]的提取方法进行优化，称取样品粉末0.5 g于锥形瓶中，加入50 mL 75%乙醇，20 ℃下超声0.5 h，过滤，滤液旋蒸至无醇味，转移至分液漏斗，加入适量水饱和，正丁醇萃取2次，合并正丁醇层，旋蒸至干，加入甲醇复溶并定容至10 mL容量瓶中，摇匀，作为皂苷待测液（Ⅳ），按唐昭领等[25]优化的香草醛-冰醋酸-高氯酸法进行测定。每个指标重复测定3次。

1.3  数据处理

以测定的芦丁等8种化学成分含量为变量，对26份不同的金花茶叶数据进行主成分分析和聚类分析，所有数据运用Excel 2007软件和SPSS 20.0软件进行数据处理和分析。对数据进行标准化处理后，进行主成分分析，得主成分特征向量、特征值、方差贡献率。特征值表示对应主成分能够反映原有信息的多少[26]，以特征值大于1的确定主成分，再以累积贡献率≥80%为选择主成分依据[27]。运用SPSS 20.0软件，采用组间平方和，欧氏距离法对26份金花茶样品进行聚类分析。

2  结果与分析

2.1  供试品溶液制备

预实验考察不同提取方法（超声和回流）、不同浓度（95%、70%、50%）乙醇作为提取溶剂及pH对4种黄酮的提取效果，结果见图1。最终确定样品制备方法为取金花茶叶样品粉末1 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入50%乙醇0.1 mol/L盐酸（10∶1）16.5 mL，密塞，称定重量，超声提取60 min（功率100 W，频率50 kHz），放冷，称定重量，用50%乙醇-0.1 mol/L盐酸（10∶1）补足减少的重量，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。对照品与样品的色谱图结果见图2。

2.2  HPLC法同时测定金花茶叶中芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量

2.2.1  线性关系考察  精密吸取1.2.2（2）方法制备的混合对照品储备液0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、4、6、10 mL于10 mL量瓶中，分别加入9.95、9.9、9.75、9.5、9、8、6、4、0 mL甲醇稀释至刻度，即得系列浓度对照品溶液。精密吸取10 μL，在1.2.2（1）项色谱条件下进样，以质量浓度（x）为横坐标，以峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线。按3倍信噪比计算4个成分的检测限（LOD），按10倍信噪比计算4个成分的定量限（LOQ）。结果表明（表2），芦丁、槲皮素、木犀草素和山奈酚相关系数均大于0.9998，线性良好。

2.2.2  精密度试验  精密吸取混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚的峰面积，结果显示4个被测物峰面积相对标准偏差（relative standard deviation， RSD）分別为1.20%、1.82%、2.74%、1.12%，表明仪器的精密度良好。

2.2.3  稳定性试验  取供试品溶液分别于0、2、6、10、12、24、48 h进样10 μL，计算得4个被测物峰面积RSD分别为0.54%、2.60%、3.25%、6.44%，结果表明供试液在48 h内稳定。

2.2.4  重复性试验  精密称取同一批金花茶叶样品6份，按2.1方法制备供试品溶液，分别进样，测定峰面积，计算各质量浓度的RSD。计算得4个被测物峰面积RSD分别为0.84%、2.65%、2.52%、1.79%，结果表明该方法重复性良好。

2.2.5  回收率试验  取已知含量的金花茶叶粉末，每份0.5 g，共9份，精密称定。每3份加入相同量（分别为已知含量的80%、100%、120%）的芦丁、槲皮素、木犀草素和山奈酚对照品，按2.1方法制备供试品溶液，在1.2.2（1）色谱条件下测定含量，结果芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚平均加样回收率分别为93.39%、95.26%、103%、95.67%，RSD分别为2.48%、2.90%、3.04%和2.79%，结果表明该回收率符合方法学考察要求，表明该方法准确度高，符合成分分析要求。

2.2.6  样品含量测定  分别取不同种源和不同月龄金花茶叶样品粉末1 g，精密称定，按2.1方法制备供试品溶液，进样10 μL后测定峰面积，代入标准曲线计算其含量，4种黄酮含量结果见表3。结果表明，不同种、不同月份之间的金花茶在芦丁、槲皮素、木犀草素和山奈酚含量之间存在差异，然而这4种成分含量均较低，甚至在个别样品中无法测试出来，可以作为不同样品之间的化学成分标志。

2.3  UV法测定金花茶叶茶多酚、总黄酮、总多糖、总皂苷含量

由表3可见，5年生不同种的金花茶组植物品质具有一定差异，无名金花茶的茶多酚、总黄酮、总多糖、总皂苷含量均高于其他金花茶，四季金花茶次之，其次为显脉金花茶、防城金花茶和凹脉金花茶。8年生防城金花茶1—12月采收金花茶叶，4种生理活性成分含量高低顺序为总皂苷>总黄酮>茶多酚>总多糖，均在10月达到最高值，除茶多酚外，总皂苷、总黄酮和总多糖含量均表现为升-降-升-降的趋势;芦丁、山奈酚含量无明显变化规律，木犀草素在1—2月含量较高，槲皮素和木犀草素在3—8月无显著变化，槲皮素在9—12月呈逐渐上升趋势。

2.4  不同金花茶叶质量的化学计量学分析

2.4.1  主成分分析  由表4可知，特征值大于1的主成分有3个，其中第1主成分特征值为2.681，方差贡献率为33.511%;第2和第3主成分特征值分别为2.117和1.144，方差贡献率分别为26.461%和14.299%;按照累积贡献率≥80%提取4个主成分，第4个主成分特征值为0.832，贡献率为10.399%，4个主成分的累积贡献率达84.671%。以特征向量为权重得4个主成分的表达式为：

Z1=0.241X1+0.032X2-0.099X3+0.362X4+0.565X5+0.588X6+0.166X7+0.328X8

Z2=0.106X1?0.539X2+0.564X3+0.097X4?0.101X5+0.073X6+0.561X7?0.202X8

Z3=0.737X1?0.004X2+0.036X3?0.580X4?0.141X5+0.020X6+0.007X7+0.314X8

Z4=?0.015X1+0.402X2+0.514X3+0.372X4?0.261X5?0.220X6?0.008X7+0.565X8

式中X1为芦丁的含量，X2为槲皮素的含量，X3为木犀草素的含量，X4为山奈酚的含量，X5为茶多酚的含量，X6为总黄酮的含量，X7为总多糖的含量，X8为总皂苷的含量。

由主成分特征向量所占权重可知各指标对主成分的贡献大小，第1主成分主要反映了总黄酮、茶多酚、总皂苷和山奈酚4个线性分量，其中总黄酮和茶多酚的特征向量达0.5以上;影响第2主成分的主要成分是木犀草素、总多糖，而与槲皮素呈显著负相关;主成分3中，芦丁具有关键正影响作用，而山奈酚则呈负相关性;主成分4则主要反映了槲皮素、木犀草素、总皂苷的含量变化影响。而总黄酮、茶多酚、总皂苷、山奈酚、木犀草素和总多糖是反映金花茶品质的综合指标，可作为金花茶质量评价的参考指标。

以前4个主成分的贡献率为权重，得主成分综合评价函数F=0.33511Z1+0.26461Z2+0.14299Z3 +0.10399Z4，式中Z1、Z2、Z3、Z4为上述4个主成分，主成分综合得分和综合排序见表5。5年生不同种及表型（S1～S14）主成分综合评分大小顺序为：无名金花茶>四季金花茶>防城金花茶（花蕾大、花多、不抗寒、花黄且大、尖果）>显脉金花茶>凹脉金花茶>小果金花茶，不同种之间存在较大的差異，其中以无名金花茶和四季金花茶得分最高。而8年生不同月份（S15～S26）主成分综合评分大小顺序为：10月采>2月采>3月采>4月采>5月采>7月采>6月采>1月采>8月采>12月采>11月采>9月采，表明即使同一品种在不同月份采集，得分截然不同，表明采收月份对金花茶生化成分具有较大影响，其中以10月和2月采的得分较高。

2.4.2  聚类分析  由图3可知，当阈值为13时，不同来源金花茶可分为5大类。S1、S2和S24各为一类，S1（无名金花茶）的特征为第1主成分得分最高，即其茶多酚、总黄酮、总多糖、芦丁含量最高;S2（四季金花茶）的特征为第2主成分得分最高，表现为总多糖、芦丁等含量较高;S24（金花茶10月采）的特征是总皂苷含量最高。S21、S22、S20、S3、S7、S16、S17、S18、S19聚为一类，该类样品大部分为8年生金花茶，第1主成分得分较高，特征为茶多酚、总黄酮、芦丁等含量较平均;S8、S9、S25、S26、S15、S4、S6、S11、S12、S5、S14、S10、S13、S23聚为一类，该类样品主要为5年生金花茶，样品特征为第2、第3或第4主成分得分较高，总皂苷和木犀草素含量较高。

3  讨论

3.1  液相提取方法和色谱条件的优化

本研究基于前人研究的方法[28-29]，进一步比较了不同浓度（95%、70%、50%）乙醇提取溶剂和pH对4种黄酮的提取效果，结果以50%乙醇?0.1 mol/L盐酸（10∶1）提取率高。考察了回流和超声2种提取方法对成分提取率的影响，结果显示，回流提取率略高于超声提取，但杂质明显多于超声提取，故选择提取高效、操作更简便的超声提取法。

参考牛广俊[30]测定金花茶叶黄酮的液相方法，对被测成分进行190～800 nm全波长扫描，结果4种黄酮成分在260 nm和360 nm附近均有最大吸收峰，但260 nm下杂质峰吸收干扰大，因此选择对待测组分干扰更少的360 nm为检测波长。同时考察了梯度洗脱以及不同流动相（甲醇∶水，甲醇∶磷酸水，甲醇∶乙酸水）对色谱分离的影响，结果表明甲醇：磷酸水洗脱峰形优于甲醇：水，且对待测峰分离效果优于甲醇∶乙酸水，杂质峰少，基线更稳定，因此采用甲醇∶磷酸水为流动相。与牛广俊[30]的梯度洗脱方法相比，改进流动相，减少进样量，可以达到待测成分保留时间适中、分离较好的效果。

3.2  不同来源金花茶叶生化成分含量分析

罗昭润等[31]研究认为金花茶需经5年栽培才能采摘加工，故本研究选择5年及以上树龄为研究对象。研究结果表明，5年生不同种的金花茶组（S1～S14）生化成分具有一定差异，无名金花茶引自越南，其芦丁、茶多酚、总黄酮、总多糖、总皂苷含量均高于其他金花茶，四季金花茶次之，其次为显脉金花茶、防城金花茶和凹脉金花茶。小果金花茶为金花茶的变种，仅分布于广西南宁地区[32]，8种成分含量相对较低，与王坤等[33]发现从越南引种金花茶比广西本地金花茶总黄酮等4种活性成分高的结果一致，说明不同种的金花茶直接影响叶片的品质。5年生不同表型防城金花茶（S7～S14）中S7（花多）、S9（花蕾大）和S8（花黄大）总皂苷含量达6.12%～7.30%，显著高于其他表型金花茶，而叶肥厚和叶短圆表型的金花茶活性含量较低，与牛广俊[30]研究的19类金花茶叶宽、叶长与品质呈正相关性结果一致，均说明叶表型影响金花茶活性成分，而表型受遗传与环境因素双重影响，有待进一步探讨与研究。

本研究对8年生防城金花茶（S15～S26）叶片成分含量做了动态分析，4种生化活性成分含量顺序为总皂苷>总黄酮>茶多酚>总多糖，均在10月含量达到最高值，而芦丁、山奈酚、木犀草素、槲皮素含量均较低，变化规律不明显，对生产上的采收期具有参考价值。

3.3  不同来源金花茶叶主成分分析与聚类分析

基于化学计量学的主成分分析的综合评分，常用于评价样品综合质量[34-35]，本文率先建立了以8种成分为指标进行综合评分评价金花茶样品的方法。5年生不同的种及表型间，无名金花茶和四季金花茶叶片品质的综合评分均比防城金花茶、凹脉金花茶、显脉金花茶和小果金花茶高，即无名金花茶和四季金花茶相对于其他金花茶叶片品质较优。不同表型防城金花茶中，花表型较大、颜色较黄、花数量较多的类型其叶片品质更好。8年生防城金花茶不同月份采收中，2—4月和10月采收的叶片的总黄酮、茶多酚等含量较高，其综合评分也较高，表明春季2—4月和秋季10月适合采收防城金花茶成熟叶，其品质更优，这与生产实际基本一致，从理论上解释了春茶和秋茶口感好、品质优的原因。

聚类分析是一种按数据内在规律客观合理地分类的方法[26]，在阈值为13时，不同来源金花茶可分为5类，S1、S2和S24各为一类，综合评分位于前三位，而5年生和8年生金花茶叶各聚为一类，综合评分靠后，与主成分分析结果基本类似，说明不同种、不同树龄及采收时间对金花茶品质均有影响，与前人研究结果基本一致[19， 33]。无名金花茶、四季金花茶和防城金花茶中花蕾大、花多、不抗寒、花黄且大的表现型的生化成分较优，即通常称之为品质较优，可作为良种选育的材料。在采收时，应注意按种源、树龄分批处理，并加强采收时间管理，以保证加工原料的一致性。

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