基于JAK2/STAT3/VEGF通路探讨周氏固金消瘤汤抗人肺腺癌A549细胞的机制研究

吴吟秋，王载川，张晓春，苏兆亮，4，刘延庆，5，侯超,5

(1.江苏大学医学院，江苏 镇江 212013；2.扬州大学医学院，江苏 扬州 225009；3.南京中医药大学附属扬州市中医院，江苏 扬州 225002；4.江苏大学国际基因组学研究中心，江苏 镇江 212013；5.国家中医药管理局胃癌毒邪论治重点研究室，江苏 扬州 225009)

肺癌是当今我国及世界范围内发病率及死亡率最高的恶性肿瘤，严重影响人们健康[1-2]。大量研究证实中医药在肺癌治疗中具有重要价值。国医大师周岱翰教授总结50余年肺癌治验，认为肺癌不离“痰、瘀、毒、虚”四字，常以益气除痰法为主，辅以化瘀解毒、软坚散结，自拟效验方周氏固金消瘤汤用于非小细胞肺癌患者的治疗，对抑制癌瘤生长，放化疗的增效减毒，改善生存质量及延长生存期均有一定帮助[3]。JAK2/STAT3通路作为非小细胞肺癌防治研究领域一个重要的途径，与细胞的增殖、迁移等生物学行为密切相关[4-5]。为进一步证实周氏固金消瘤汤的抗肿瘤效应，本研究拟从人肺腺癌A549细胞增殖、凋亡及肿瘤血管生成等恶性生物学行为多种重要途径及环节的影响，多方面探讨周氏固金消瘤汤的药效机制，旨在为该复方的开发及应用提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 周氏固金消瘤汤由守宫6 g，薏苡仁30 g，人参15 g，百部20 g,干蟾皮10 g,生南星15 g,龙葵20 g,浙贝母20 g组成。药材购自扬州市中医院中药房，经张晓春主任医师鉴定为正品。

1.1.2 细胞株 人肺腺癌A549细胞株及HUVEC细胞株购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库，人肺腺癌A549细胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基；HUVEC用内皮细胞培养液(10%胎牛血清的RPMI1640+1%ECGS)于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中传代培养。

1.1.3 实验动物 获取雄性BALB/c-nu裸鼠20只，5～6周龄，体质量为(16±2)g，由扬州大学比较医学中心提供，许可证号：SCXK(苏)2017-0007。实验在国家癌症研究所提供的指导方针下进行，已获扬州大学动物伦理审查委员会批准(YXYLL-2020-110)。

1.1.4 主要试剂 CCK-8试剂盒(同仁化学研究所，批号：NM598)；Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒(联科生物，批号：AP105)；Bax、Bcl-2、p-STAT3、STAT3、p-JAK2、JAK2、β-actin抗体(CST，批号：5023、3498、9145、12640、4406、3230、4970)；VEGF抗体(Affinity Biosciences，批号：AF5131)；HRP标记二抗(CST，批号：7074)；超敏ECL化学反应发光试剂盒(新赛美生物科技有限公司,批号：19091716)；基质胶(美国康宁公司，批号：356234)；ECGS(ScienCell,批号：#1025)；Transwell小室(美国BD公司,0.4 μm，批号：3016695)。

1.1.5 主要仪器 3107型CO2细胞培养箱，美国Forma Scientific公司；Ti-U倒置荧光显微镜，日本尼康公司；Synergy HTX多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；DVB胶片，美国Kodak公司；Accuri C6流式细胞仪，美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 周氏固金消瘤汤冻干粉药液制备 按周氏固金消瘤汤(ZSGJXLT)处方组成准确称取各中药饮片，经煎药机煎煮成汤剂(按机器规程操作)。60 ℃浓缩成合生药量2.11 g/mL药液。严格按照LABCONCO Freeze Dry System冻干机说明书操作，将药液冻干为粉，溶解稀释为5、10、20、40、80 μg/mL的不同浓度药液。

1.2.2 CCK-8法测定对A549细胞活性的影响 取对数生长期细胞接种于96孔板，每孔5 000个细胞，置培养箱中孵育过夜。加入不同浓度的ZSGJXLT药液，设定空白对照组，每组5个复孔，药物分别作用12、24 h及36 h后，每孔加入10 μL的CCK-8，放置培养箱孵育1 h，用酶标仪(450 nm波长)测吸光度值(OD)。根据公式计算细胞存活率=(OD实验孔-OD空白孔)/(OD对照孔-OD空白孔)×100%。

1.2.3 Annexin-V/7AAD流式细胞术检测对A549细胞凋亡影响 取对数生长期细胞接种于6孔板，每孔3×106个细胞,置培养箱中孵育过夜。加入不同浓度(0、5、10、20、40、80 μg/mL)ZSGJXLT培养24 h，每个剂量设定3个平行组。收集细胞，PBS洗涤2次，Binding buffer 100 μL重悬，加入5 μL Annexin-V和1 μL 100 μg/mL 7AAD室温避光孵育15 min，流式上机检测。

1.2.4 体外血管形成实验观察对血管生成的影响 小室内建立共培养体系，取对数生长期A549细胞，胰酶消化后调整为5×104个/孔，接种于共培养小室的上室，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，在加药组分别给予不同浓度的(0、5、10、20、40、80 μg/mL)ZSGJXLT。同时在24孔细胞培养板内添加300 μL基质胶(下室)，置于细胞培养箱内凝固1 h。待充分凝固后以5×104个/孔的密度将HUVEC均匀接种于基质胶表面。共同孵育24 h后，每个剂量设定3个平行组，拍照保存，统计封闭管腔形成数量。

1.2.5 Western blot检测对A549细胞相关蛋白表达的影响 按1.2.3的方法进行铺板，加入不同浓度的ZSGJXLT培养24 h后，加入RIPA裂解液80 μL，冰上裂解30 min，收集细胞于离心管中，4 ℃下以12 000×g离心15 min，收集上清，BCA法进行蛋白定量，金属浴变性10 min。SDS-PAGE电泳，冰浴中电压100 V转膜2 h，取出PVDF膜，7%脱脂奶粉封闭液封闭1 h，置于一抗稀释液中，4 ℃脱色摇床上孵育过夜，回收一抗，TBST洗膜，每次15 min，重复3次，二抗37 ℃孵育2 h后，回收二抗，TBST洗膜，每次15 min，重复3次，暗房用ECL化学发光法显影，Image J软件对图像进行分析。

1.2.6 小鼠A549肺癌移植瘤模型的构建和给药 取对数生长期的A549细胞消化后，用生理盐水调整细胞悬液浓度至1×107mL-1，接种于BALB/c-nu裸鼠腋窝皮下部位，每只接种0.2 mL。约1周左右可在接种处扪及米粒大小瘤体，提示接种成功。根据小鼠体质量随机分层分组为模型组，ZSGJXLT低、中、高剂量组和顺铂组。分别予生理盐水及低、中、高剂量(生药质量浓度分别为0.25、1、4 g/kg)ZSGJXLT灌胃。ZSGJXLT连续给药21 d后解剖小鼠，剥离移植瘤，称取移植瘤质量并计算抑瘤率，抑瘤率=(对照组平均瘤质量-给药组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量×100%。

2 结果

2.1 周氏固金消瘤汤对A549细胞增殖的影响

如图1所示，与对照组相比，ZSGJXLT对A549细胞的活性有明显的抑制作用，抑制率具有时间和浓度依赖性(P<0.01)，计算得到24 h的IC50为40.86 μg/mL。

注：同一时间点，与对照组比较，

2.2 周氏固金消瘤汤对A549细胞凋亡的影响

如图2～3所示，与对照组相比，ZSGJXLT作用A549细胞24 h后可明显诱导A549细胞凋亡，并呈浓度依赖性。

图2 不同浓度ZSGJXLT对A549细胞凋亡的影响

注：与对照组比较，

2.3 周氏固金消瘤汤对肺癌细胞相关蛋白的影响

如图4所示，与对照组相比，用药组VEGF、p-STAT3、p-JAK2、STAT3等蛋白表达均明显下调(P<0.05)，Bax/Bcl-2蛋白明显上调(P<0.05)，均呈浓度依赖性(图4～5)。

图4 各组A549细胞中相关蛋白的表达情况

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 周氏固金消瘤汤对血管生成的影响

周氏固金消瘤汤对HUVEC小管形成的影响如图6～7所示，与对照组相比，ZSGJXLT组HUVEC环状血管结构减少，差异有统计学意义(P<0.05),且呈浓度依赖性。

图6 不同浓度ZSGJXLT对HUVEC体外小管形成的影响

注：与对照组比较，

2.5 周氏固金消瘤汤抑制A549肺癌荷瘤小鼠肿瘤的生长

与模型组比较，不同浓度的ZSGJXLT(0.25、1、4 g/kg)可明显抑制肿瘤的生长(P<0.05),且呈浓度依赖性，且肿瘤质量的下降趋势具有明显的剂量依赖性。ZSGJXLT(0.25、1、4 g/kg)抑瘤率分别为21.66%、35.52%和48.24%。与低剂量实验组比较，中、高剂量实验组的抑瘤率升高，且高剂量实验组高于中剂量实验组。结果表明ZSGJXLT对A549肺癌荷瘤小鼠的肿瘤生长具有明显的抑制作用(图8～10)。

图8 各组间的肿瘤对比

注：与模型组比较，

注：各组ZSGJXLT(0.25、1、4 g/kg)之间的比较，**P<0.01。

3 讨论

肺癌相当于中医的“肺积”“息贲”等病名，根据脏象学说，在肺癌演变过程中，肺与脾的病理关系主要表现在生气不足和水液代谢失调。“肺为主气之枢，脾为生气之源”“脾为生痰之源，肺为贮痰之器”，脾虚痰湿是肺癌的关键病机。国医大师周岱翰教授针对中晚期肺癌患者，强调“痰”与“虚”的中医病机，认为处于这一特定阶段肺癌的病理特征是以“虚”为本，以“痰”为标，突出“培土生金”的治疗理念，提出“益气除痰”治疗大法[4]。多中心、前瞻性队列研究证实了以益气除痰方药为主的中医药综合治疗在延长Ⅲ、Ⅳ期非小细胞肺癌老年患者的中位生存期及延缓肿瘤进展方面，均与化疗作用相当，与化疗联合应用可使患者中位生存期达12个月，其中脾虚痰湿型患者可达到13个月，对于复治和非鳞癌患者，中医药治疗较化疗具有更好的疗效[3，5]。周氏固金消瘤汤是周老基于益气除痰法而拟定，该复方由守宫、薏苡仁、人参、百部、干蟾皮、生南星、龙葵、浙贝母组成，其中守宫、薏苡仁除痰散结为君，人参、百部益气健脾，润肺止咳，干蟾皮、生南星、龙葵燥湿化痰，散结解毒，共为臣药，浙贝母清热化痰，解毒散结为佐使。全方寒温并用，攻补兼施，标本同治，共奏益气除痰，解毒消癥之效。药理研究已证实周氏固金消瘤汤组分干蟾皮提取物蟾蜍灵[6]、人参[7]等提取物可通过直接细胞毒、促凋亡及抗肿瘤血管生成等作用发挥抑瘤效应。

JAK-STAT信号通路是一条由上游细胞因子刺激，通过调节下游靶基因如Bcl-2、Bax、c-Myc、VEGF及Cyclin D1等表达，参与细胞增殖、分化、凋亡、血管生成等重要生物学过程的信号通路[8]。许多肿瘤手术标本均有JAK-STAT信号通路的异常表达，尤其STAT3作为一种促进细胞增殖与存活的原癌蛋白，其持续性激活导致细胞失控性增生并加速细胞迁移，如蔡勋全等[9]比较直肠癌病理组织和正常直肠组织相关蛋白表达，发现与正常组织相比，直肠癌组织中STAT3、p-STAT3、Cyclin D1和Bcl-2蛋白的表达也明显高于正常直肠组织，且与直肠癌分化程度、淋巴转移有关。Bcl-2和Bax分别作为Bcl-2家族中的抗凋亡因子及促凋亡因子在肿瘤细胞凋亡中发挥重要作用[10]。VEGF是生理和病理性血管生成所必需的促血管生成因子[11]。STAT3作为信号转导子和转录激活蛋白家族成员之一，其异常激活可上调VEGF表达[12]。综上所述，JAK2/STAT3/VEGF通道在肿瘤增殖、凋亡、血管生成等恶性生物学行为中发挥重要作用，可作为非小细胞肺癌防治研究领域一个重要的干预途径，为中药复方药效机制的研究提供新的思路。