中药活性化合物高良姜素与吉非替尼抗非小细胞肺癌的协同增效作用及机制研究

沈存思，杨福州，项莹颖，陈古月，纪建建，张正光

(1.南京中医药大学中医儿科学研究所，江苏省儿童呼吸疾病(中医药)重点实验室，江苏 南京 210023；2.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023；3.南京中医药大学医学院·整合医学学院，江苏 南京 210023)

肺癌属于呼吸系统占位性疾病，也是目前全球众多癌症中发病率与死亡数最高的癌症类型，且呈现不断上升的趋势。肺癌各年龄段皆有发生，其中非小细胞肺癌患者占肺癌患者总数的80%左右。化疗是非小细胞肺癌的基础治疗方案，而近年来靶向治疗亦成为临床常见的治疗手段[1]。Gefitinib作为一种口服表皮生长因子受体酪氨酸激酶的抑制剂(EGFR-TKIs)，在非小细胞肺癌治疗领域得到了广泛应用。然而，许多患者在使用Gefitinib后1年内便会产生耐药现象，这使其临床应用受到了极大限制，是临床使用Gefitinib治疗非小细胞肺癌的瓶颈之一[2]。

高良姜为双子叶植物姜科植物高良姜AlpiniaofficinarumHance的根茎，除去叶、须根及鳞片，洗净，切成小段晒干，即可作为中药饮片入药使用。该药属于温里药物，具有温胃止吐，散寒止痛的功效。Galangin来源于高良姜，是一种天然黄酮类化合物(图1)。文献研究发现，Galangin具有抗菌、抗氧化等多种药效作用，近年来，Galangin的抗肿瘤作用亦得到广泛关注[3]。研究显示，Galangin通过抑制STAT3所调节的NF-κB及Bcl-2/Bax等通路增强顺铂、阿帕替尼等化疗药物对肿瘤细胞的抑制作用，具有较好的协同增效作用[4-6]。提示姜黄素可能具有增加吉非替尼抗癌作用的潜力。本文利用体外细胞实验，探讨了Galangin与Gefitinib对抗非小细胞肺癌细胞A549可能的协同作用及相关机制，为Galangin在抗肿瘤领域的进一步应用提供更多的科学依据。

图1 高良姜根茎、饮片及Galangin分子式

1 仪器与材料

1.1 实验药物及细胞

Gefitinib购自于北京索莱宝生物科技有限公司，Galangin购自于成都瑞芬思生物科技有限公司，A549细胞购自于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 实验耗材

96孔细胞培养板(Thermo Fisher Scientific公司)，6孔细胞培养板(Corning公司)，移液器(Thermo Fisher Scientific公司)，EP管(AXYGEN公司)，冻存管(Corning公司)，15、50 mL离心管(Corning公司)，T25、T75细胞培养瓶(Corning公司)，PVDF膜(Millipore公司)。

1.3 实验试剂

RPMI-1640培养液、磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.4)、0.25%胰蛋白酶溶液(不含EDTA)、青霉素-链霉素双抗(100×)(上海源培生物科技有限公司)，胎牛血清(Gibco公司)CCK-8(DOJINDO公司)，Annexin V-Alexa Flour 647/PI凋亡检测试剂盒(南京福麦斯生物技术有限公司)，DMSO(BIOSHARP公司)，ELC化学发光超敏显色试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)，RIPA裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物、DEPC水、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(上海碧云天生物公司)，脱脂奶粉(安佳)，p-STAT3(Tyr705)抗体、STAT3抗体、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP(Cell Signaling Technology公司)，p-EGFR、EGFR、Bcl-2抗体、Bax抗体、β-actin抗体、HRP*Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(Immunoway公司)。

1.4 实验仪器

超净工作台(ACB-4A1，ESCO公司)，常温离心机(5702，Eppendorf公司)，倒置显微镜(090-135.001，Leica公司)，CO2细胞培养箱(MCO-20AIC，SANYO公司)，数显恒温水浴锅(HH-4，上海析达仪器有限公司)，Infinite多功能酶标仪(M200 Pro，TECAN公司)，流式细胞仪(AccuriTMC6 Plus，BD公司)，超声波细胞裂解仪(SONOPULS mini 20，Bandelin公司)，高电流电泳仪电源(PowerPac HC，BIO-RAD公司)，垂直电泳槽(VE-180，上海天能科技有限公司)，蛋白印记-多功能成像系统(GelDoc 2000，BIO-RAD公司)。

2 方法

2.1 A549细胞的培养

将非小细胞肺癌细胞A549培养在含有10%胎牛血清以及1%青霉素-链霉素双抗的RPMI-1640培养液中，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养。

2.2 CCK-8法检测Gefitinib及Galangin对A549细胞活力的影响

将细胞悬液密度调整为5×104mL-1，以100 μL每孔接种于96孔培养板，于培养箱中培养过夜。用PBS填充96孔板四周空白孔，分别用不同浓度梯度的Gefitinib及Galangin以单用或联用的方式处理细胞。其中Gefitinib浓度梯度为：0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μmol/L；Galangin浓度梯度为：1.5、3、6、12、24、48、96、192 μmol/L。培养48 h后，吸去各孔中的溶液，向不同组别各孔中分别加入100 μL含10% CCK-8的培养液，在培养箱中孵育1 h左右。用酶标仪测定各孔在450 nm处的OD值，计算Gefitinib及Galangin单用和联用对A549细胞活性的影响以及相应的IC50值。

2.3 Gefitinib及Galangin联合指数的计算

根据文献报道，运用Chou-talalay法，使用CompuSyn软件进行两药联合指数(Combination index，CI)的计算，研究两种药物间的相互作用。以CI<1表示协同作用；以CI=1表示为叠加作用；以CI>1表示为拮抗作用[7]。

2.4 细胞凋亡检测

将细胞悬液密度调整为5×105mL-1，接种于6孔培养板。于培养箱中培养过夜后，以合适浓度的Galangin与Gefitinib单用或联用的方式处理细胞24 h。按照Annexin V-Alexa Flour 647/PI凋亡检测试剂盒的要求，用不含EDTA的胰酶将各组别细胞消化后，以100 μL稀释后的结合缓冲液重悬细胞，置于1.5 mL离心管中，分别加入5 μL Annexin V和10 μL PI溶液，于室温下避光孵育15 min。加入400 μL PBS后，过200目筛，用流式细胞仪进行凋亡检测，以FlowJo 10.5软件进行分析，绘制凋亡图。

2.5 Western blot实验

使用加入了蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞，超声破碎得到蛋白液。通过BCA定量法测定蛋白液的浓度，将不同组别样品用RIPA裂解液稀释至同一浓度。加入蛋白上样缓冲液，充分混匀后置于干式恒温器中变性。在配制好蛋白凝胶后，将各组样品上样。通过电泳、转膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗、显色的步骤进行实验，检测相关蛋白的表达水平。

2.6 统计学分析

3 结果

3.1 Gefitinib及Galangin对A549细胞活性的影响

CCK-8法检测Gefitinib与Galangin单用及联用对A549细胞活性的影响。图2结果显示，使用不同浓度的Gefitinib及Galangin单用及联用处理A549细胞48 h后，均对细胞活性产生了抑制作用。图3结果表明，当使用1.5、3、6、12、24、48、96、192 μmol/L的Galangin分别联合0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μmol/L的Gefitinib处理细胞48 h后，CI值分别为0.558、0.592、0.543、0.372、0.536、0.504、0.462、0.716。当Galangin浓度为12 μmol/L，Gefitinib浓度为2 μmol/L时，给药48 h，其CI值为0.372，提示二者协同作用最佳，故采用此最佳协同浓度进行后续实验。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 Gefitinib及Galangin对A549细胞凋亡的影响

图4结果显示，2 μmol/L Gefitinib 及12 μmol/L Galangin在单用及联用时均具有促进A549细胞凋亡的作用，Gefitinib与Galangin联用促凋亡作用更明显，显著优于两药单用时产生的促凋亡作用，进一步提示二者在促细胞凋亡方面具有协同增效作用。

3.3 Gefitinib及Galangin对A549细胞相关蛋白表达的影响

以Western blot检测各组细胞中p-EGFR、EGFR、p-STAT3、STAT3以及凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、Bax、Bcl-2的表达水平。图5结果显示Gefitinib及Galangin可抑制p-EGFR、p-STAT3和Bcl-2的表达，促进Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、Bax的表达，且二者联用对蛋白水平的影响更为显著。

注：Galangin 12 μmol/L；Gefitinib 2 μmol/L； 与对照组比较，**P<0.01。

注：Galangin 12 μmol/L；Gefitinib 2 μmol/L； 与对照组比较，**P<0.01。

4 讨论

近年来，由于空气污染、吸烟、病毒感染等因素，呼吸系统疾病的发病率逐年增高，其中肺癌是我国发病率及死亡率位列第一的恶性肿瘤[8]。目前主流的保守治疗方法以化疗为主要手段，通常会采用TKI抑制剂，如Gefitinib，能明显缓解疾病进展，延长患者生存期[9]。然而原发性及获得性耐药降低了Gefitinib的药物疗效。Galangin来源于姜科植物高良姜，是一种具有较好药理活性的天然黄酮类化合物，其作用包括抗肿瘤、抗炎、抗过敏、抗氧化等。多项研究显示Galangin对多种呼吸系统疾病，包括哮喘、气道炎症、肺部肿瘤等都具有良好的治疗效果[10-11]。

STATs蛋白家族介导细胞生理过程，在维持细胞内环境稳定和细胞生长、分化等过程中发挥不可或缺的作用[12]。其中STAT3作为多个受体酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase，RTK)信号通路下游一个重要的调节因子，其作用广泛，在细胞的增殖分化、炎症发生发展及肿瘤微环境中都扮演着重要角色[13]，也是连接炎症和肿瘤的关键信号分子。Gefitinib为小分子酪氨酸激酶抑制剂，能够抑制EGFR及交联信号的活化，而STAT3是与EGFR信号有交联的重要信号之一。EGFR信号活化后，磷酸化的EGFR及其下游分子可直接磷酸化STAT3，磷酸化后的STAT3自细胞质转位到细胞核内调控靶基因表达。STAT3过度活化亦与多种肿瘤的发生、发展密切相关。通过抑制STAT3信号活化能够诱导细胞的凋亡，而促进肿瘤细胞凋亡是抑制肿瘤发生发展的重要途径[14]。凋亡关键蛋白Bcl-2位于线粒体外壁，是STAT3信号转导的下游靶基因之一，可以通过控制线粒体通透性和抑制细胞色素c的释放调节细胞凋亡[15]。Bax是与Bcl-2同源的水溶性蛋白，是Bcl-2家族中促细胞凋亡的蛋白[16]。本实验发现Galangin与Gefitinib联用具有良好的协同抗癌作用，能显著抑制A549细胞增殖、促进细胞凋亡，且细胞中EGFR、STAT3的磷酸化水平有所降低，凋亡关键蛋白Bax和Bcl-2的表达亦呈显著变化。而最新研究[17-19]也表明，利用特异性小分子抑制剂靶向STAT3，阻断STAT3相关信号通路的激活，能有效抑制肿瘤生长、诱导肿瘤细胞凋亡。综上，本次研究提示了Galangin作为一种具有抗癌作用的中药活性化合物，通过协同增加Gefitinib对EGFR/STAT3信号通路相关蛋白的抑制作用，协同增强Gefitinib的抗癌效果，深入机制及临床适用性仍需进一步探索和验证。