循环肿瘤细胞检测在妊娠绒毛膜癌中的应用

中国抗癌协会肿瘤标志专委会CTC 技术专家委员会

中国CTC 产业联盟

广东省医学会精准医学与分子诊断学分会

妊娠绒毛膜癌（gestational choriocarcinoma，GC）是高侵袭性、高度恶性和罕见的一种妊娠滋养细胞肿瘤。GC 发病率具有明显的地域差异，在中国约1/2 882 次妊娠，在东南亚约9.2/4 万次妊娠，日本约3.3/4 万次妊娠，而北美和欧洲相对较低，约1/4 万次妊娠［1⁃2］。当前，基于化疗等多种治疗方法的应用以及监测β⁃绒毛膜促性腺激素（beta human chorionic gonadotropin，β⁃HCG）水平波动来评估疾病变化，使大部分GC 得以有效治疗［3⁃4］。但由于GC 极易发生血源性播散，造成肺、肝、中枢神经系统转移，仅通过β⁃HCG 水平监测并不能完全揭示和评估某些病例表现出的早期及多处转移状态、化疗耐药等重要临床信息［5］。此外，由于国际妇产科联盟（the Interna⁃tional Federation of Gynecology and Obstetrics，FI⁃GO）分期和国际妇产科联盟/世界卫生组织（the International Federation of Gynecology and Obstet⁃rics/World Health organization，FIGO/WHO）预 后评分系统主要依赖影像学检查和实验室β⁃HCG检查，不能在早期区分出可能产生化疗耐药的病例。因此，进一步探索有效的临床指标以评估病情、动态监测病情变化、评价治疗反应及精准判断预后，对妊娠绒毛膜癌的临床管理具有重要意义。

1 循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）概念及特点

1.1 CTCs 的概念

CTCs 的来源主要为癌症原发灶或转移灶，进入血液循环进行播散，在肿瘤病灶形成、发展和转移过程中发挥重要作用。进入循环系统的CTCs绝大多数被机体免疫系统消灭或经诱导发生自身凋亡，而部分CTCs 则经历上皮⁃间质转化（epithelial⁃mesenchymal transition，EMT）或间质⁃上皮转化过程（mesenchymal⁃epithelial transition，MET）获得高度侵袭性，从而形成新的病灶，据研究进入循环的CTCs 最后约0.01%可形成新病灶［6］。

1.2 CTCs 的特点

典型的CTCs 可表达上皮性标记物，如细胞角蛋白或上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhe⁃sion molecule，EpCAM）而基本不表达造血细胞标记物，如CD45。CTCs 在血液中十分罕见，每毫升血液中大约只有1～100 个，虽然增加血液样本量是提高检测效率的有效解决方案，但可造成患者的潜在危害增加，且在实际应用有具有局限性。此外，CTCs 的异质性也是检测中的一个主要障碍，因为不同亚群的CTCs 在生物标志物表达方面有着显著差异。同时，根据目前的单细胞分析，发现CTCs 蛋白质表达还存在时间和空间异质性，表明除了CTCs 数量以外，不同的CTCs 可能包含不同的生物学信息［7⁃8］。类似于肿瘤细胞的时间和空间异质性，CTCs 的表型在患者的不同疾病时期可发生转变，从而反映肿瘤发生转移、耐药和免疫逃逸等特点。因此，对CTCs 的检测和研究对GC 的临床应用以及基础研究具有重要意义。

2 CTCs 的检测技术

CTCs 在外周血中分布极其稀少，在常用的7.5 mL 外周血中仅能捕获数个CTCs。因此目前的检测策略一般分为两步，首先根据其特性进行分离富集，再对富集的可疑细胞进行鉴定，以确定是否为CTCs［9］。

2.1 CTCs 分离富集技术

CTCs 与正常血液中存在的细胞在物理特性和生物学特性方面均存在差异，这些差异是用来分离富集CTCs 的理论基础。

2.1.1 基于物理特性的分离富集技术

应用CTC 物理特性（如大小、密度、电荷等）进行分离富集可不破坏CTCs 形态，不依赖CTCs 的表面抗原，同时兼容多种下游分析技术，利于后续对单个CTCs 进行形态学、免疫细胞学及生物信息学特征的研究。见表1。

表1 CTC 分离富集技术Table 1 CTC separation and enrichment technology

2.1.2 基于肿瘤细胞生物学特性的分离富集技术

该技术是依据免疫学原理，应用磁珠、黏附、白细胞去除等方法通过细胞表面分子标记进行阳性或阴性选择进行CTCs 的分离富集。阳性富集是利用肿瘤相关抗原的特异性抗体对CTCs 进行捕获，阴性富集是利用白细胞特异性表面抗原去除白细胞后进而富集CTCs。阳性富集方法有CellSearch系统、CTC⁃Chip 系统、AdnaTest 癌细胞检测系统、MACS 系统、RARE 系统、MagSweeper 系统、GEDI系统、GO nanosheets 系统、VerIFAST 系统、Immuno⁃microbubbles 系统、GILUPI CellCollector 系统等。阴性富集方法有Cyttel 系统。

2.1.3 基于肿瘤细胞学物理特性以及生物学特性结合的分离富集技术

以上两种方式各有优缺点，因此将两种方法结合的NanoVelcro 系统，不仅利用了CTC 的物理特性，还综合了表面的CD147 以及EpCAM 分子特征，从而进一步提高CTC 分离富集效率。

CTCs 作为一种直观可靠的肿瘤检测指标，可成为妊娠绒毛膜癌辅助分期、预后判断、疗效及复发监测等诊疗过程中重要的检测手段。目前，CTCs 检测方法虽种类繁多，但在妊娠绒毛膜癌中尚无高效准确的整体解决方案，尤其在自动化结果判读等方面，因此亟需发展更加灵敏、特异、快速的检测体系。

3 CTCs 检测流程

目前商品化的CTCs 检测平台众多，而Cytolu⁃mina 公司的NanoVelcro 系统通过将纳米材料微孔滤膜过滤装置与细胞表面的CD147 和EpCAM 分子结合，从而提高GC 中CTC 的检测效率，其在目前众多检测技术中具有代表性，下面简述该系统的检测流程。

收集GC 患者的外周血（7.5 mL），保存在CellSave 管中（管中包含固定剂）。置入集成设备中进行PBS 冲洗后，加入固定剂和通透剂进行孵育约30 分钟，随后加入抗EpCAM 和抗CD147抗体，最后进入微流控装置进行分离富集。鉴定方法采用三色免疫细胞化学方法用来确定。该方法包括TRITC 结合抗CD45 抗体（CD45 标记白细胞），FITC⁃结合抗HCG 抗体（HCG，标记妊娠绒毛膜癌细胞蛋白质）以及DAPI 进行核染色，分离的细胞中呈现HCG+和DAPI+则被鉴定为CTCs。

4 CTCs 的临床意义

4.1 CTCs 与妊娠绒毛膜癌预后

多年来，FIGO 分期和FIGO/WHO 预后评分系统不仅在反映妊娠绒毛膜癌致远处转移方面发挥了关键作用，而且在某种程度上可用于评估妊娠绒毛膜癌患者的预后［27］。然而FIGO 分期和FIGO/WHO 预后评分系统有一些局限性，因为它们主要基于影像学检查和实验室检查，未能识别可能发展为化疗耐药性的病例。此外，高水平的β⁃绒毛膜促性腺激素不能同时反映疾病风险和预后［28］。最新研究表明CTCs 计数在妊娠绒毛膜癌患者中的具有预后评价意义［29］。大约96%的妊娠绒毛膜癌患者在7.5 mL 血液中包含≥2 个CTCs［16］，同时所有FIGO 分期IV 期的患者在化疗前检测到CTCs≥2［30］。研究表明每7.5 mL≥6 个CTCs 可以作为妊娠绒毛膜癌患者预后不良的标志［29］。随着妊娠绒毛膜癌进展，如FIGO 分期所反映的，CTCs≥6 的患者百分比逐渐增加。对于FIGOⅢ期或者Ⅳ期患者，在单因素分析中，以治疗前存在6 个CTCs 为分层依据可以有效区分无进展生存期（progression⁃free survival，PFS）和总体生存期（overall survival，OS）。2000年修正的FIGO妊娠滋养层肿瘤分类中包括了经典的解剖预后因素。因此，CTC 计数作为是否发生转移可供参考的指标，可能有助于在妊娠绒毛膜癌诊断时对FIGO 分期进行更准确地分层［31］。

4.2 CTCs 与妊娠绒毛膜癌转移

CTC 计数在评估妊娠绒毛膜癌是否发生转移中也存在作用，并提示CTC 计数≥6 的患者全身多器官转移的风险增加。虽然妊娠绒毛膜癌中肺转移最常见，但脑转移患者常因颅内出血或颅内压升高而出现严重的神经系统症状［32］。如果转移部位位于纵膈、松果体或腹膜后组织，单次组织活检很难在术前诊断［33］。因此，“液体CTC 活检”不仅能反映妊娠绒毛膜癌的转移过程，而且比在特定时间进行的单个组织活检更能提供生物标志物状态方面的信息。

5.3 CTCs 与妊娠绒毛膜癌治疗

在临床中，大约30%的患者（FIGO 评分为6 分或更低，被认为具有较低的耐药风险）最终对甲氨蝶呤或放线菌素D 单药化疗产生耐药性［34］。主要基于FIGO/WHO 预后评分系统的妊娠绒毛膜癌的化疗方案的制定，可能不能动态真实地代表异质性肿瘤。传统上，β⁃HCG 是诊断妊娠绒毛膜癌和评估疾病状态的理想肿瘤标志物［34］。然而，越来越多的关于假阳性检测结果的证据引起了人们对未来β⁃HCG 临床应用的关注，这就产生了对妊娠绒毛膜癌患者新指标的需求。FIGO 评分和β⁃HCG 水平作为预后标记，与研究中CTC 计数为6 作为分类标志的二分变量相比，这些标记在单因素和多因素分析中表现出较差的区分能力。

目前，对于妊娠绒毛膜癌在化疗缓解后何时停止化疗尚无国际公认的指南。一些专家建议，当检测不到血清β⁃HCG 时立即停止化疗，特别是对低风险妊娠绒毛膜癌患者［35］。也有专家建议首次血清高血糖⁃HCG 结果正常后提供额外的两个疗程，甚至3～4 疗程［35］。有研究表明，在化疗前后两个时间点CTCs 数量对预后有提示作用［36］。首先，治疗前的CTCs 计数＜6 的妊娠绒毛膜癌患者的PFS 比那些CTCs 计数≥6 的妊娠绒毛膜癌患者的PFS 更长，提示简便的CTC 计数评估可以用来评估患者是否受益于当前的化疗方案［36］。另外，化疗一周期后CTC 数仍然为或变成≥6 的妊娠绒毛膜癌患者，更倾向为耐药，提示可能需要变更治疗方案［29］。

5 展望

CTCs 起源于原发灶或转移病灶并扩散至外周血循环，是肿瘤血行转移的来源，具有重要的临床价值，尤其是可作为多种不同癌症类型的预后标志物。CTC 检测作为一种简单、无创、易于重复的“液体活组织检查”，提供了在治疗过程中实时动态监测肿瘤状态的机会。作为一种新的生物标志物，CTCs 还有助于肿瘤生长和转移的关键生物学机制研究。由于妊娠绒毛膜癌的研究目前缺乏充足的组织标本、理想的细胞系和动物模型，增加了CTCs 在妊娠绒毛膜癌的研究的挑战性。同时，CTCs 在术前系统治疗的早期诊断、评估和管理，以及术后微小残留疾病和癌症复发的动态检测方面的应用研究尚不充分，需要更深入的临床探索。另外，不同CTC 检测技术系统对GC 患者中CTCs 数量与临床指标之间的关系的截断值需作相应的检测与验证，以便为临床诊疗提供更精准的指导。

虽然CTCs 目前在妊娠绒毛膜癌的诊治中没有广泛应用，但是CTCs 检测和计数在血源性传播的妊娠绒毛膜癌中应用前景明朗。CTCs 计数有助于对高危妊娠绒毛膜癌患者进行分层，以便进行早期临床干预和评估化疗效果，实现个体化治疗。本共识的制定旨在对CTCs 检测在妊娠绒毛膜癌中的应用起到初步的释疑及指导作用，未来还需要更大标本量，更详尽的研究提供更充分有力的证据用于临床。