非小细胞肺癌伴随诊断的研究进展

赵子慧，王绪华

(天津康圣达医学检验实验室有限公司，天津 300300)

国家癌症中心发布的中国2019年最新癌症报告显示，在中国每10万人口中有57人患有肺癌，其中每年约有63万人死于肺癌，并且患病趋势逐年递增。随着国民健康意识的增强和螺旋CT等早期筛查技术的发展和应用，在新增肺癌患者中，首次确诊为中晚期肺癌的比例有所下降。但肿瘤的异质性、晚期治疗效果不佳、预后差等因素造成肺癌患者5年相对生存率仅16.1%，且据统计数据显示，中国肺癌人口的死亡数高于世界平均水平。如何有效进行早期诊断和延长肺癌患者的生存率，一直是中国乃至世界肺癌临床治疗中的主要关注点。

肺癌是中国乃至世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，临床上分为小细胞癌和非小细胞癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中绝大多数是NSCLC，占80%～85%。不同组织亚型、驱动基因导致的NSCLC患者对于同一治疗方式会产生不同的治疗效果和预后。对于多数早期NSCLC患者，手术切除肿瘤仍是首选的治疗方式。晚期NSCLC患者，病灶发生转移，手术无法达到预期的治疗效果。因此对NSCLC进行准确分期、确定亚型、分析分子标记物以及驱动基因，选择合适的治疗手段和靶向药物是晚期NSCLC合理且更有效的治疗策略。相关数据表明，接受了靶向药物和免疫治疗的NSCLC患者预后得到改善，生存期得以延长。

为确保患者靶向用药安全和治疗效果，伴随诊断(companion diagnostic，CD)应运而生。伴随诊断是一种体外诊断技术，可提供安全有效的信息为患者药物和治疗方案的选择提供依据，并且帮助医护人员确定治疗对患者的获益是否超过潜在的副作用或风险。伴随诊断的优势概括来讲，具有以下两点：①可以帮助医生充分了解患者信息，制定最佳治疗方案；②可以帮助患者规避用药风险，节省大量开支，降低医疗成本。本文主要阐述当前NSCLC伴随诊断中的分子标记物和相关的检测手段。

1 分子生物标记物

根据最新版美国国立综合癌症网络(national comprehensive cancer network，NCCN)非小细胞肺癌治疗指南，将表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)、肉瘤致癌因子-受体酪氨酸激酶(ROSproto-oncogene1，receptortyrosine kinase，ROS1)、鼠类肉瘤病毒基因同源体B(v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B，BRAF)、免疫治疗靶点程序性死亡配体(programmed cell death ligand 1，PD-L1)、神经营养因子受体酪氨酸激酶(neurotrophic receptor kinase，NTRK)纳入常规临床分子检测，并建议检测新的分子靶标间充质-上皮转变(mesenchymal-epithelial transition，MET)、原癌基因(proto-oncogene，RET)、人表皮生长因子受体-2(human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2)及肿瘤突变负荷(tumor mutational burden，TMB)以评估不同人群对不同靶向药物的药敏性及预后。

1.1 临床检测分子标记物

EGFR是一种受体型酪氨酸激酶，在细胞膜上表达。正常情况下，EGFR胞外端与配体结合形成二聚体，胞内端与ATP结合后发生磷酸化，然后激活多种下游信号通路，如蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、酪氨酸激酶(Janus kinase，JAK)、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)等信号通路，调节细胞生长、分化和发育等多种生理过程。EGFR突变会造成EGFR结构域的活化，异常激活下游信号通路，促使肿瘤细胞恶性增殖。EGFR突变常见于肿瘤细胞中，包括NSCLC，在亚洲NSCLC患者中，EGFR突变约占50%，且EGFR的突变多发生在18～21号外显子上，目前已经检测到的EGFR突变约70余种。多种小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKI)通过阻断EGFR信号向下游信号通路的传递，用于NSCLC的治疗。

ALK是NSCLC的驱动基因之一，有1%～7%的NSCLC患者中会出现ALK重排，目前临床上已经发现有多种异常基因重排，ALK-EML4重排是NSCLC中最常见的类型。临床研究发现ALK重排的NSCLC患者对EGFR-TKI具有耐药性。

BRAF蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，有1%～2%的NSCLC患者表现为

BARF

基因突变，

BRAF

V600E是最常见的突变亚型，临床研究发现同时出现

BARF

突变、

EGFR

突变、

ALK

重排和

ROS1

重排，在NSCLC患者中比较罕见。

ROS1也是一种受体型酪氨酸激酶。与EGFR类似，ROS1重排后会导致下游信号通路持续激活，促使细胞恶性增殖。有1%～2%的NSCLC患者会表现出ROS1重排，且多数出现在EGFR突变、KRAS突变和ALK重排3者皆是阴性的患者中。

KRAS是GTPase活性的G蛋白，是MAP/ERK途径的一部分。

KRAS

基因突变驱动的NSCLC患者人数仅次于

EGFR

基因突变患者，是NSCLC的第二大驱动基因，

KRAS

突变状态也预示着EGFR-TKI类药物缺乏疗效。

KRAS

突变通常不会与

EGFR

、

ROS1

、

BRAF

和

ALK

基因变异重叠。因此，

KRAS

突变检测可能会识别出无法从进一步的分子检测中受益的患者。靶向治疗目前尚不能用于具有

KRAS

突变的患者。

PD-L1是NSCLC的免疫筛查点，肿瘤细胞上表达的PD-L1蛋白与T细胞上的程序性死亡受体(programmed cell death 1，PD1)结合，阻止T细胞对肿瘤细胞的识别。基于以上机制，NSCLC的免疫疗法是靶向药物通过竞争结合PD-L1/PD-1免疫位点，激发或调动机体的免疫系统，增强抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞，恢复患者的免疫系统，使其可以被正常激活。

1.2 其他相关分子标志物

随着跨学科研究的推进，新的NSCLC驱动基因被发现，成为潜在的分子治疗靶标，如

ERBB2

突变、

RET

基因融合、高水平MET扩增肿瘤突变负担(TMB)均是NSCLC新的驱动基因。尽管NCCN指南建议可将上述标志物作为NSCLC晚期患者生物标志物的筛查范围，但这些新的生物标记物目前广泛应用到实际临床检测中仍需要大量的临床试验。

2 生物标志物检测方法

就目前分子标记物的检测方法看，尽管同一分子标志物可以用不同的方法进行检测，但不同检测技术的成本、检测灵敏度不同(表1)。临床应用可根据NSCLC患者的具体情况，选择合适的检测技术。

表1 NCCN推荐的非小细胞肺癌分子靶标的主要检测方法

免疫组化(immunohistochemistry，IHC)检测方法可检测某个基因的全蛋白表达，可以检测新鲜肿瘤组织、石蜡组织、胸腹水等不同来源的样本，具有检测灵敏度高，检测周期短且检测成本相对比较低等优势。但免疫组化检测是一种半定量检测技术，检测结果受抗体质量影响很大，对抗原表达程度的判断主要通过人眼识别，主观因素影响大。随着其他技术的发展，IHC多用于分子标记物PD-L1的检测。

最新版的美国病理学家联合学会(CAP)/国际肺癌研究协会(IASLC)/分子病理学协会(AMP)肺癌治疗指南推荐使用具有高灵敏度和特异性的克隆号为5A4和D5F3的ALK抗体检测。其中NCCN指南建议可采用IHC的方法快速初筛评估

ALK

重排情况，后续用荧光原位杂交(fluorescence

in situ

hybridization，FISH)确认，FDA批准的利用IHC方法检测ALK重排的[D5F3]CDx Assay试剂盒无需后续FISH判断。PD-L1的检测尚无统一标准，但NCCN推荐使用FDA批准的4个检测试剂Ventana PD-L1 SP263测定法、Dako 28-8 PharmDx、22C3 PharmDx和Ventana PD-L1 SP142测定。FISH可用于检测

ALK

重排、

ROS1

基因融合和

NTRT

基因融合。FISH可以检测肺癌新鲜组织、石蜡组织、细胞悬液等多种来源的样本，具有检测周期短、特异性高、结果易于观察的优势。但缺点是FISH探针的设计需要明确待测基因的检测位点，因此FISH只能定性检测到目的基因重排。并且较多的测试步骤容易使信号丢失，造成假阴性结果。FISH作为检测

ALK

重排的金标准，是NCCN治疗指南和CAP/IASLC/AMP肺癌治疗指南推荐的检测

ALK

重排方法之一。NCCN推荐使用FDA批准的雅培公司的Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit评估

ALK

重排情况。一代测序Sanger测序法可以检测

EGFR

突变和

BRAF

突变，是目前临床上检测

EGFR

突变的常用方法之一。Sanger测序法可以检测新鲜组织和石蜡组织切片。尽管Sanger测序可以检测已知突变位点和未知突变，但是检测灵敏度相对较低，通常只有超过20%的突变才可以被检测到，但检测成本低、周期短是其最大的优势，被认为是NSCLC中检测

EGFR

突变的“金标准”，也是目前临床上用于检测

EGFR

突变最通用的方法之一。

二代测序(next-generation sequencing，NGS)具有高通量的测序特点，可以同时检测除PD-L1外的所有分子标志物的已知和未知点突变、重排或基因融合，可检测标本遗传变化，筛选新的驱动基因或生物标志物。NGS的灵敏度比Sanger测序高得多，并且根据测序深度，原则上可以检测到低至0.1%的等位基因频率。但是NGS周期长，通常需要10～20个工作日，且成本较高。目前NGS多用于检测多个指标的肿瘤方案，为患者选择个性化治疗方案提供信息。

实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)可用来检测基因突变，检测样本可以是新鲜组织、血清和石蜡组织等多种来源的核酸，操作简单、检测成本低、周期短、结果可视。与Sanger测试法类似，qPCR只能检测已知突变，但检测时间远低于Sanger测序。利用qPCR方法检测NSCLC的

EGFR

突变、ALK重排、

ROS1

基因融合、

NTRT

基因融合在临床上被广泛应用。突变扩增系统(amplification refractory mutation system，PCR-ARMS)可检测新鲜组织、血清、胸腹水和保存少于2年的石蜡组织，优势是特异性高、检测时间短、灵敏度远高于Sanger测序法。与qPCR相比，PCR-AMRS检测基因突变只能对已知突变进行检测，无法检测未知突变。PCR-ARMS也是NCCN指南和最新版CAP/IASLC/AMP指南推荐的检测

EGFR

已知突变的方法之一，在临床上检测上得到广泛应用。

3 伴随诊断市场现状

最早出现的伴随诊断产品是1998年FDA批准的一种名为赫赛汀的靶向药物产品。尽管目前该领域中已经有相当多的生物医学相关的知名企业包括Dako(安捷伦科技)、Qiagen公司、罗氏、雅培、Ventana医疗、生物梅里埃(bioMerieux)、Myriad Genetics、Resonance Health、及Leica Microsystems等正与制药公司合作开发伴随诊断试剂盒，但事实上伴随诊断市场仍然处于发展阶段，大量产品处于研发时期。美国是目前伴随诊断产品和技术最先进的国家，占伴随诊断市场的30%。

肿瘤学是伴随诊断市场中创收最高的疾病领域，多种用于各类癌症生物标志物检测的伴随诊断产品被开发，截止到2020年1月，FDA共批准了38个伴随诊断产品，与肿瘤相关的高达36个，涉及包括NSCLC在内的多种肿瘤如乳腺癌、NSCLC、卵巢癌、B细胞慢性淋巴细胞性白血病等多种靶向药物的诊断。其中用于NSCLC的伴随诊断试剂共9种，涉及15种靶向药物的伴随诊断(表2)。

中国尚无明确的关于伴随诊断的定义或法规条文，国内审批通过的NSCLC伴随诊断产品共3个，

ALK

基因断裂荧光原位杂交法检测试剂盒(Vysis ALK break apart FISH probe kit)、PD-L1免疫组织化学法检测试剂盒(PD-L1 IHC 22C3 pharmDx)和新一代cobasEGFR突变检测试剂盒(cobasEGFR mutation test v2)，以体外诊断试剂的名目归类在3类医疗器械中。目前国内获批上市肿瘤相关的3类医疗器械诊断试剂盒约800种，其中与NSCLC相关的检测试剂盒最多，这意味着NSCLC的伴随诊断在中国有潜在的巨大市场。

4 伴随诊断面临的挑战

目前FDA批准的NSCLC伴随诊断多数只针对单一分子指标，并不能满足患者的实际临床治疗需求。随着临床上NSCLC联合治疗的运用，越来越多的潜在生物靶标被发现，促进了多指标的NSCLC伴随诊断产品的发展，例如Foundation One CDx，利用NGS可以同时检测

EGFR

突变、

ALK

和

ROS1

重排及

BRAF

突变。NSCLC的临床诊断技术在不断革新，新的伴随诊断产品的发展必将结合不同的技术方法(如多重IHC分析、NGS测序、代谢组学等)，整合多种检测结果的信息，为患者更精准的个性化治疗方案提供帮助。然而如何整合这些技术，提供可靠的整合信息，是包括NSCLC在内的所有伴随诊断面临的一大难题。伴随诊断试剂因为使用不同的诊断技术、试剂和平台，与使用单一技术的检测试剂价格会有所不同。大多数情况下，伴随诊断价格昂贵，且未纳入医保。因此，高昂的价格促使人们选择那些有相等或可接受的灵敏度和特异性的替代检测方法和诊断试剂盒。如2013年FDA批准上市的检测

EGFR

突变的伴随诊断试剂therascreen EGFR RGQ PCR，其利用PCR方法检测

EGFR

突变阳性的NSCLC患者适宜接受吉非替尼、阿法替尼、达克替尼这3种药物治疗。然而实际临床中，NCCN推荐的检测

EGFR

突变的方法包括但不限于PCR，用于体外诊断检测

EGFR

突变的试剂盒多达数十种。高昂价格使得NSCLC伴随诊断试剂的临床应用效果并不理想。生物标记物发展与靶向药物的发展不平衡也是伴随诊断难以广泛应用于临床的一个问题。FDA批准的PD-L1伴随诊断体系Ventana PD-L1 SP142利用IHC方法检测PD-L1的表达，PD-L1阳性的患者适宜接受阿替利珠单抗用于免疫治疗。但是，实际情况是一些IHC显示PDL1强阳性的患者并不一定对免疫疗法有反应，伴随诊断试剂的完善需要靶向药物的研发作支撑。

基于中国的人口基数、NSCLC的发病率以及国内市场上明确的伴随诊断产品的空白等原因，中国伴随诊断的市场发展潜力巨大，但中国想要发展自己的伴随诊断产品仍然有实际困难。首先，国内没有明确的伴随诊断的定义和相关法规条文，缺乏有效的市场监管体系。其次，伴随诊断产品对灵敏度和特异性的要求很高，而影响伴随诊断检测的结果较多，包括样本来源、处理时间、保存方式、操作人员的熟练程度等均可能影响结果的判定。所以明确定义，制定严格的生产标准，行业准则，规范市场监管体系是国内伴随诊断产品发展首先要解决的问题。

表2 FDA批准可用于非小细胞肺癌的伴随诊断产品[41]

5 总结与展望

NSCLC作为全球致死率较高的肿瘤，改善预后、提高患者的生存率一直是临床关注的主要问题，而肿瘤异质性是NSCLC患者预后较差的主要原因。随着人们医疗意识的提升，检测手段和靶向药物的发展，NSCLC患者的生存率得到了一定程度的改善。伴随诊断以靶向药物用药安全为出发点，通过多种检测技术整合检测信息，为患者提供较为精确的用药建议，从而达到个性化、精准化医疗的目的。伴随诊断可以帮助医生充分了解患者信息，疾病进展，为患者制定最佳治疗方案，规避用药风险，达到节省开支，降低医疗成本的作用。对于相关企业来讲，开发伴随诊断产品、明确靶向药物的应用特性，有助于新药研发和产品定位，可推动企业扩大市场，带来更多利润。尽管中国伴随诊断市场的开发仍有多种实际困难，但伴随诊断的研发应用可以使多方获益，是诊断市场发展的一大趋势。