甲基丙烯酸环氧丙酯诱导16HBE细胞恶性转化过程中细胞凋亡相关lncRNA的筛选及功能研究

马顺鹏，王全凯，王 苗 ，宋佳阳，乌瀚宝栎尔，谢广云，许建宁，

(1．中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所，北京 100050；2．中国疾病预防控制中心化学污染与健康安全重点实验室，北京 100050)

环境有害化学物质的潜在致癌性风险是其安全性评价必不可少的内容，细胞转化试验作为评价化学物致癌作用的重要手段，与啮齿类动物的致癌性试验相比，能够有效缩短检测致癌作用时间，减少实验动物的使用数量，从而为新化学品的生产、使用和职业人群的防护工作提供重要的证据支持。

甲基丙烯酸环氧丙酯(glycidyl methacrylate，GMA)作为双官能团单体的一种，可以通过双键和环氧基团参与离子型或自由基的交联聚合反应，主要用于丙烯酸树脂、乙烯基和环氧树脂的生产。在牙科用密封胶、复合材料和黏合剂、骨复合材料、粉末涂料、水凝胶镜片和食品接触材料中均有广泛应用。近期世界卫生组织下的国际癌症研究机构IARC完成了对GMA的致癌性评估，根据“强有力”的致癌机制证据以及“充分”的实验证据，GMA被归类为“对人类很可能致癌物质”(Group 2A)。

本课题组研究发现，在GMA诱导人支气管上皮16HBE细胞恶性转化过程中，可致基因表达谱和表观遗传层面发生异常改变，但这一过程涉及的细胞功能改变及其机制仍需作进一步探讨。有研究表明，细胞凋亡水平的改变与哺乳动物细胞的恶性转化和肿瘤进展过程密切相关。因此，本研究拟对GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程中细胞凋亡率改变进行研究，并探究其可能发生机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

GMA，购于美国Sigma公司，纯度≥98.5%；二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司；胰蛋白酶、EDTA-Na购于美国Amresco公司；MEM培养基粉购于美国Hyclone公司；标准胎牛血清购于美国Gibco公司；100×的青链霉素混合液购于北京索莱宝科技有限公司；细胞固定液和细胞凋亡检测试剂盒(FITC Annexin-V Apoptosis Detection Kit with PI)均购自美国BioLegend公司，Trizol试剂购于上海碧云天生物技术有限公司，2×PCR master mix购于美国Arraystar公司。

CO培养箱购于美国Thermo公司；台式高速低温离心机购于美国BECKMAN公司；倒置显微镜购于日本Olympus公司；流式细胞仪购于美国ACEA艾森生物公司；紫外可见分光光度计购于美国UNICO公司；7900HT Fast Real-Time PCR仪购于美国Biosystems公司；ND-1000分光光度计购于美国NanoDrop公司；ViiA 7实时定量PCR反应体系购于美国Applied Biosystems公司；Arraystar Human lncRNA Microarray V4.0芯片技术服务和引物设计的技术支持由上海康成生物公司提供。

1.2 细胞培养与转化

人支气管上皮细胞(16HBE)来自美国加利福尼亚大学。液氮冻存的16HBE细胞复苏后，使用10%标准胎牛血清(FBS)的MEM培养液，于37℃、CO体积分数为5%的恒温培养箱中培养。基于课题组既往关于GMA的细胞毒性和克隆形成率的研究结论，我们选择8 μg/mL的GMA重复染毒诱导16HBE细胞发生恶性转化。取对数生长期的细胞进行接种，24 h后向培养液中加入6 μL浓度为8 μg/mL的GMA进行染毒(DMSO作为溶剂对照)。每次染毒时间为72 h，间隔24 h后进行2次染毒，重复染毒3次后结束染毒，记为第1代，MEM培养液调整为5%FBS继续培养。课题组既往研究已经证实，传代培养至第30代，GMA染毒组的16HBE细胞具备恶性转化细胞的生物学特性。基于此，我们将第10、20和30代的GMA染毒组细胞，记为转化前、中和后期。

1.3 细胞凋亡率检测

分别收集GMA染毒组和DMSO对照组的第10、20和30代细胞，对细胞凋亡率进行检测。胰蛋白酶-EDTA消化细胞，然后细胞固定液洗涤2次，1 200 r/min离心5 min；加入含Ca的缓冲液混悬细胞，将细胞浓度调整为5×10个/mL；取100 μL细胞悬液于5 mL流式管，依次加入5 μL的FITC Annexin-V，10 μL的碘化丙啶(propidium iodide，PI)，涡轮振荡器振荡，保证细胞均匀分布，25℃避光孵育15 min，最后加入400 μL的含Ca的缓冲液，上机检测。其中Annexin-V阳性、PI阴性代表凋亡早期的细胞，位于流式细胞象限图的右下方，凋亡早期细胞的比例Annexin-V阳性，而PI阳性代表晚期细胞的凋亡比例，位于象限图的右上方，两者之和即为细胞凋亡率。

1.4 LncRNA芯片分析

收集GMA染毒组和DMSO对照组的第10、20和30代细胞，使用Trizol提取总RNA，无核酸酶水和RNA清洁纯化试剂盒对提取的总RNA进行分离纯化，然后通过NanoDrop ND-1000检测RNA的浓度和纯度，于-80℃保存备用。

分离提取符合要求的总RNA样品后，Arraystar RNA Flash标记试剂盒用于样品标记，然后使用Agilent SureHyb进行杂交实验，杂交完成后洗涤芯片，采用Agilent DNA Microarray Scanner扫描芯片的信号值，经过标准化处理得到lncRNA表达谱的差异表达情况。

最后，通过检索GMA重复染毒诱导16HBE细胞恶性转化过程中第10、20和30代lncRNA表达谱的差异表达结果，筛选得到细胞凋亡相关lncRNA，生物信息学数据库预测lncRNA CFLAR-AS1的靶基因和可能存在的生物学功能。

1.5 qPCR检测lncRNA CFLAR-AS1的表达水平

使用逆转录试剂盒(Invitrogen)将提取好的总RNA样品合成cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)反应。反应体系(10 μL)包括：2×Master Mix 5 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA模板2 μL及无核酸酶水2 μL；扩增条件为：95℃，预变性10 min；95℃，变性10 s；60℃，退火60 s，40个PCR循环。分别以管家基因

β-actin

为内参，同时期DMSO对照组的平均值为基准， 2的方法计算相对表达水平。管家基因及目的基因的引物序列见表1。

表1 qPCR引物序列

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，细胞凋亡率、lncRNA表达水平的比较采用单因素方差分析，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 GMA重复染毒诱导16HBE细胞恶性转化过程中细胞凋亡率的检测结果

取DMSO对照组和GMA染毒组的第10、20和30代细胞分别检测其细胞凋亡率，结果如表2所示。与同时期DMSO对照组相比，第10代GMA染毒组的细胞凋亡率明显升高，且两者的差异具有统计学意义；而第20代GMA染毒组的细胞凋亡率低于同时期DMSO对照组(

P

＜0.05)，第30代GMA染毒组的细胞凋亡率与同时期DMSO对照组比较无明显差异(

P

＞0.05)。

表2 GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程细胞凋亡率的变化情况(±s，%)

2.2 GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程中细胞凋亡相关lncRNA的芯片筛选结果

对GMA诱导16HBE细胞恶性转化的3个时期lncRNA芯片数据和lncRNA临近编码基因进行关联分析，筛选出与细胞凋亡过程相关的lncRNA(表3)。发现与同时期DMSO对照组相比，lncRNA CFLAR-AS1在细胞转化的第10、20和30代分别下调22%、上调244%和下调30%。其他筛选到的lncRNA芯片分析结果在这3个时期无明显改变。

2.3 GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程中lncRNA CFLAR-AS1的表达水平

qPCR检测结果见表4，在GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程中，与同时期DMSO对照组细胞相比，lncRNA CFLAR-AS1在第10、20代细胞中分别下调42%、上调442%(均为

P

＜0.05)，第30代细胞与同时期对照组比较，差异无统计学意义(

P

＞0.05)。此外，3个时期的相对表达水平变化趋势与芯片分析的结果一致。

表3 细胞凋亡相关差异lncRNA的芯片分析结果

表4 qPCR检测不同时期16HBE细胞lncRNA CFLAR-AS1的相对表达水平

2.4 LncRNA CFLAR-AS1的可能作用靶点CFLAR芯片分析结果

为进一步探究lncRNA CFLAR-AS1的生物学功能和作用机制，检索NCBI BLAST、DIANA TOOL等生物信息学数据库发现，lncRNA CFLAR-AS1是CFLAR的反义RNA(见图1)，提示CFLAR很可能是CFLAR-AS1的一个作用靶点。芯片分析结果显示，CFLAR在第10、20和30代的差异倍数均未超过2倍，分别上调27%、下调30.6%和下调31%。

图1 LncRNA CFLAR-AS1与CFLAR在2号染色体上的位置关系

3 讨论

细胞凋亡是动物细胞程序性死亡的一种形式。有研究表明，当外界环境发生变化如接触外源性化学物时，凋亡信号通路可以被激活，通过产生凋亡细胞缓和细胞损伤的发生。本研究采用GMA重复染毒诱导16HBE细胞发生恶性转化，观察细胞恶性转化的第10、20和30代GMA染毒细胞的凋亡率变化情况。结果发现与同时期DMSO对照组相比，第10代GMA染毒组的细胞凋亡率明显升高，第20代GMA染毒组的细胞凋亡率降低，第30代两组细胞相比较无明显差异。这表明在细胞转化的前期，细胞凋亡参与GMA重复染毒16HBE细胞的早期损伤修复。随着细胞损伤修复的完成，与同时期对照细胞相比，细胞恶性转化中期GMA染毒组的细胞凋亡率降低，转化完成后两者凋亡率无明显差异。

细胞凋亡这一过程伴随着多种基因的激活及相互调控作用，其中细胞凋亡的负向信号传导途径使得发生恶性转化的细胞避免死亡，从而进一步完成细胞恶性转化。许多蛋白质家族可作为负向调控因子抑制细胞凋亡，如抗凋亡因子Bcl-2蛋白，促生长因子CFLAR，BNIP3和FADD等。也有学者研究发现，lncRNA可在表观遗传水平上，通过调控凋亡基因表达影响细胞凋亡率变化。我们在GMA诱导16HBE细胞恶性转化的第10、20和30代芯片分析结果中，通过筛选细胞凋亡相关差异lncRNA，发现lncRNA CFLAR-AS1在细胞转化的第10、20和30代分别下调22%、上调244%和下调30%。qPCR验证lncRNA CFLAR-AS1的表达水平，lncRNA CFLAR-AS1在第10、20和30代分别下调42%、上调442%和下调9%，第10和20代的差异具有统计学意义。结合细胞凋亡率检测结果，我们推测在GMA诱导16HBE细胞恶性转化中期，lncRNA CFLAR-AS1起着抑制细胞凋亡的作用。

LncRNA CFLAR-AS1是

CFLAR

基因的天然反义转录物(natural antisense transcripts，NATs)。有研究表明，NATs可能参与调控其正义RNA编码蛋白质。CFLAR作为细胞凋亡负向调控因子，通过表达FLIP蛋白抑制细胞凋亡。但我们在mRNA表达谱芯片分析结果中发现，3个时期CFLAR的差异倍数均未超过2倍，这提示lncRNA CFLAR-AS1可能不是通过CFLAR的NATs来影响细胞凋亡率。

综上，在GMA诱导16HBE恶性转化过程中，转化前期凋亡率升高，转化中期凋亡率下降，这一时期lncRNA CFLAR-AS1可能发挥抑制细胞凋亡的作用，但其作用机制有待进一步研究。