2,4-二氯苯氧乙酸对幼龄SD大鼠肝毒性的研究

黄立利，张梦云，刘科亮，庞定国，刘丽达，徐培渝，

(1．四川大学华西公共卫生学院毒理与病理学系，四川 成都 610041；2．苏州瑞博生物技术有限公司毒理部，北京 100085；3．四川省疾病预防与控制中心毒理所，四川 成都 610041)

2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)是一种可以作为植物生长抑制剂的特殊激素，因其毒性相对适中而成为应用最广泛的除草剂之一，被用于种植农业、牧场、森林管理、花园和水生植被的控制。人和动物接触被这种除草剂污染的空气、饮用水、土壤和食品可能会造成健康风险。体内研究发现，大鼠暴露于100 mg/(kg·d)2,4-D可能导致少突胶质细胞低髓鞘形成。72.5 mg/kg 2,4-D可干扰大鼠生殖器官的发育，产生生殖毒性。亚慢性低剂量2,4-D暴露改变了小鼠血浆酰基肉碱水平并诱导肠道微生物群紊乱，影响肠道微生物群的组成和功能。已有文献证实，2,4-D可通过活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生引起肾脏氧化损伤，最终导致器官组织的退行性和坏死改变。肝脏是积聚农药代谢物的主要部位，因此，作为维持葡萄糖和脂质稳态最重要的器官和相关酶产生的器官，肝脏可以成为2,4-D毒作用的靶点。目前2,4-D在动物和人体内的毒性机制尚不十分明确。已有的研究提示2,4-D在体内和体外均可能会产生肝细胞氧化应激。对鱼肝细胞的体外研究发现，即使在低浓度下2,4-D也会破坏细胞能量代谢，使氧利用率下降导致维持细胞内环境稳态的ATP供应不足，增加氧化应激，从而造成肝损伤；在体内研究中也发现2,4-D可以抑制肝脏乳酸糖异生，同时降低细胞ATP水平，这与体外实验相佐证，氧化损伤可能是2,4-D造成肝毒性的途径之一。除了机体无法代偿外界化学物对细胞的损伤而导致细胞坏死以外，细胞的死亡还可能是由程序化的凋亡过程启动的。有学者进行体外研究发现2,4-D可能通过破坏线粒体跨膜电位导致细胞凋亡。本研究拟用幼龄SD大鼠通过28 d重复毒性试验，从细胞凋亡、氧化应激途径进一步探讨2,4-D致肝毒性及其机制，为2,4-D所致肝毒性的作用机制及防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

SPF级刚断乳21 d的SD大鼠64只，体质量60～80 g，由四川省中医药科学院实验动物中心提供[合格证号SCXK(川)2008-19号]。适应性喂养3 d后进行试验，整个实验过程中，大鼠饲养于屏障级动物房[许可证号SYXK(川)2011-043号]。动物自由饮水和摄食，动物房温度控制在20～24℃，相对湿度保持在55%～65%。

1.2 受试品及主要试剂

2,4-D原药，纯度98%，购自北京精华耀邦医药科技有限公司；丙二醛(malonaldehyde，MDA)、还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)试剂盒以及大鼠细胞色素C酶联免疫检测试剂盒、Caspase-3、Caspase-9活性测试盒均购自南京建成生物工程研究所；小牛血清白蛋白购于Sigma公司，考马斯亮蓝G-250购自锦江区鑫鸿瑞实验仪器经营部，其余试剂均为国产分析纯，均购自成都博奥维新试剂有限公司。

1.3 动物分组和染毒方法

SD大鼠适应性饲养3 d后，随机分为4组，每组16只，雌雄各半。大鼠2,4-D经口半数致死剂量(median lethal dose，LD)值为 375～666 mg/kg，无可见作用水平(no-observed-effect level，NOEL)为15 mg/(kg·d)。因此实验设2,4-D低、中、高剂量染毒组(分别为18.125、36.250、72.500 mg/kg)和 1个阴性溶剂对照组，用1%的羧甲基纤维素作为样品溶剂，大鼠按0.01 mL/g计算灌胃体积，每天一次经口灌胃，连续染毒28 d，染毒期间，每周称量体质量2次，以此来调整给药浓度。每日观察所有幼鼠的一般行为，大小便及中毒症状，记录体质量。实验结束后，采取股动脉放血法将动物处死，同时取肝脏称量质量，之后用天平称取肝组织0.4 g，制作肝匀浆，离心后取上清液，用于肝脏组织中GSH、T-SOD和MDA的测定。同时取肝0.4 g并用生理盐水清洗后，置于冻存管中，放入液氮罐中冻存，用于细胞色素C浓度、Caspase-3、Caspase-9相对活性的测定。

1.4 组织病理检查

每只大鼠取肝脏约3 mm×4 mm，固定于40 mL(10%)的甲醛溶液中，依次经酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋之后切片，从动物肝左叶中部做横切面取材，切5～8 μm厚片，之后作常规HE染色，镜下观察。

1.5 大鼠肝匀浆中GSH、T-SOD、MDA的测定

天平称取肝组织0.4 g，放入手动玻璃匀浆器中，同时加冰生理盐水3.6 mL，将其制成肝匀浆，最后将匀浆液转入5 mL离心管中，3 500 r/min离心10 min，取上清液，转入到5 mL的EP管中。采用二硫二硝基苯甲酸[dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB]直接法检测GSH活性、黄嘌呤氧化酶法测定T-SOD活性、TBA法检测MDA浓度，测定步骤均按照试剂盒说明进行。

1.6 大鼠肝组织中细胞色素C、Caspase-3、Caspase-9的测定

从液氮中取出冻存的肝组织，放入研钵中进行研磨。研磨时，不断向研钵中加入液氮，直至将组织研磨成淡粉色细粉末状。研磨完成后称取0.1 g转入到1.5 mL带盖离心管中，加入0.9 mL PBS缓冲液，之后4℃，12 000 r/min离心15 min，取上清液。采用分光光度计在450 nm处测定标准品与样品吸光度值

D

(450)，得出标准曲线的直线回归方程，之后在回归方程上计算出与之对应的样品中细胞色素C的浓度。在400 nm处测定样品吸光度

D

(400)值来计算Caspase-3、Caspase-9相对活性，计算公式：

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况

实验期间各组大鼠除72.500 mg/kg 2,4-D染毒组以外，活动状态良好，各组动物均未出现死亡。与对照组比较，18.125与36.250 mg/kg 2,4-D染毒组大鼠染毒后体质量增长无明显差异，72.500 mg/kg组大鼠于染毒第14天起，体质量增长速度明显较对照组减缓。至染毒结束，72.500 mg/kg 2,4-D染毒组大鼠体质量与对照组比较，差异有统计学意义(

P

＜0.05)，如图1所示。

图1 2,4-D染毒对大鼠体质量的影响

2.2 2,4-D染毒对幼龄SD大鼠肝脏湿质量及脏器系数的影响

与对照组比较，72.500 mg/kg 2,4-D染毒组大鼠肝脏湿质量降低明显，且差异有统计学意义(

P

＜0.05)，如图2A所示；但该组大鼠的肝脏系数与对照组比较差异无统计学意义，如图2B所示。

2.3 幼龄SD大鼠肝脏组织的病理观察

HE染色后观察大鼠肝组织病理学改变见图3。与对照组比较，18.125与36.250 mg/kg 2,4-D染毒组肝组织未观察到明显差异(图3B、C)，72.500 mg/kg 2,4-D染毒组大鼠部分肝组织出现胆管增生，并伴有炎细胞的浸润。

2.4 2,4-D染毒对幼龄SD大鼠GSH、T-SOD、MDA的影响

大鼠肝匀浆中GSH、T-SOD、MDA的检测结果见图4。与阴性对照组比较，72.500 mg/kg 2,4-D染毒组肝匀浆中GSH含量、T-SOD活性明显降低，MDA含量显著升高，差异有统计学意义(

P

＜0.05)；36.250 mg/kg 2,4-D染毒组的T-SOD活性，与对照比较，也下降明显，差异有统计学意义(

P

＜0.05)。

2.5 2,4-D染毒对幼龄SD大鼠细胞色素C、Caspase-3、Caspase-9的影响

大鼠肝组织中细胞色素C、Caspase-3、Caspase-9的检测结果见图5。与对照组比较，36.250和72.500 mg/kg 2,4-D染毒组的肝组织中细胞色素C浓度升高明显，差异有统计学意义(

P

＜0.05)。与对照组比较，36.250和72.500 mg/kg 2,4-D染毒组的肝组织中Caspase-3、Caspase-9相对活性均明显增加，差异有统计学意义(

P

＜0.05)。

图2 2,4-D染毒对大鼠肝脏湿质量及脏器系数的影响

图3 2,4-D染毒28 d后幼龄SD大鼠肝组织切片HE染色观察病理学改变

图42,4-D染毒大鼠对GSH、T-SOD、MDA的影响

3 讨论

本研究结果显示，2,4-D可影响幼龄SD大鼠的生长，抑制其体质量的增加，因此，虽然高剂量染毒组大鼠的肝脏湿质量与对照组比较有所降低，且差异有统计学意义，但肝脏的脏器系数与对照组比较无明显变化，此外病理组织学也显示仅有部分肝组织发生胆管增生，并未表现出明显的病理损伤，需进行更详细的检查来明确胆管增生的病理意义。

图5 2,4-D染毒大鼠对细胞色素C、Caspase-3、Caspase-9的影响

细胞凋亡是指为了维持机体内环境的相对稳定，机体自发的进行基因调控，使不需要的细胞发生程序性死亡，涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用。目前认为肝细胞发生凋亡主要通过3条途径：线粒体依赖性细胞凋亡、内质网应激介导的细胞凋亡和死亡受体通路途径。Caspase-3、Caspase-9都是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族的重要成员。Caspase-9是细胞凋亡过程中比较上游的一个蛋白酶，当线粒体跨膜电位在各种类型凋亡诱导因素的作用下降低时，线粒体内、外膜之间的通透性转换孔会由关闭转换为开放，导致线粒体膜通透性增大，引起线粒体膜通透性转换作用(mitochondrial permeability transition，MPT)，线粒体释放细胞色素C到胞浆中，触发Caspases级联反应，Caspase-9与细胞色素C和Apaf1形成复合物，同时被激活，激活的Caspase-9可以进一步激活诱导细胞凋亡发生的关键酶Caspase-3，进而促进后续的细胞凋亡信号，最终导致细胞凋亡的发生。本次研究结果显示，36.250 mg/kg的2,4-D即可引起Caspase-3、Caspase-9和细胞色素C释放的增加，与对照组比较，差异有统计学意义(

P

＜0.05)，说明2,4-D可通过改变线粒体的通透性，释放细胞色素C，激活Caspase-3、Caspase-9途径，诱导肝细胞发生凋亡。

当细胞出现自由基代谢失衡时，则可导致细胞发生氧化损伤和细胞凋亡，同时氧化损伤又可加剧细胞凋亡的发生。近年来，越来越多的证据表明，ROS在许多慢性疾病、衰老和恶性肿瘤的发展进程中发挥着重要作用。农药暴露可通过产生过量ROS，如超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基、过氧自由基和单线态氧等，导致氧化应激。ROS是细胞在正常过程中产生的，在正常情况下，细胞的抗氧化系统将ROS造成的损害最小化。当ROS的产生增加到一定程度，超过了细胞的抗氧化系统清除能力，就会导致氧化应激。氧化应激发生时，机体主要表现为ROS和抗氧化防御之间的平衡受到干扰，这一过程会导致细胞功能的改变，并会对细胞结构和组织造成严重损害。肝损伤产生的过量自由基可广泛损伤肝细胞，导致肝细胞坏死、脂质大量积蓄进而引起脂质过氧化产物MDA含量显著变化。GSH和SOD是体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，其可与化学毒物或其代谢产物相结合，减少MDA的生成，进而保护细胞的结构和功能。因此GSH和SOD的含量可反映机体抗氧化的能力，而MDA的含量则可反映机体氧化损伤的程度。本次研究结果显示，36.250 mg/kg的2,4-D即可引起机体MDA的生成增加，同时降低SOD、GSH的活性，表明2,4-D可引起肝脏发生脂质过氧化反应，且随着剂量的增加，作用程度加剧。

综合以上实验结果，我们推测，2,4-D可导致幼龄SD大鼠肝毒性的发生，其发生的途径可能是通过氧化损伤和细胞凋亡，但更具体的相关毒作用机制、涉及的基因表达还需进一步研究。毒性通路是近年来的一个研究热点，指常态化的细胞反应生化通路，在被外源化学物充分扰动后导致的有害健康效应，它涵盖了本研究所提到的应激反应通路，对其进行深入研究更有助于实施外源化学物风险评估的预测策略，将实验结果进行外推，保护和促进人类健康。