PM2.5对HK-2肾细胞部分癌基因和凋亡基因表达的影响

李柏茹 ，秦双建，李闰冰，蔡 颖 ，郑 凯，王冰玉，曾 明，肖 芳，，徐新云

(1．中南大学湘雅公共卫生学院，湖南 长沙410078；2．深圳市疾病预防控制中心，广东深圳 518055；3．南华大学公共卫生学院，湖南 衡阳 421001)

《2013年全球疾病负担研究》显示，暴露于环境可吸入颗粒物在全球残疾调整寿命年(disability adjusted of life years，DALYs)风险因素中排名第12位，《2015年全球疾病负担研究》显示大气细颗粒物(fine particulate matter，PM)是第5大死亡危险因素和第6大伤残调整寿命年的危险因素，并且PM相关死亡率呈现逐年上升趋势。PM是指空气动力学当量直径≤2.5 μm的颗粒物，具有粒径小、吸附有毒有害物质、活性强等特点，可以进入人体深部呼吸道，并通过血液运输到达身体的各个部位，可对全身多个系统造成损害。国际癌症机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)已将 PM列为致癌物，黄靖等在一项国家横断面研究中发现长期暴露于浓度范围较广的PM与慢性肾脏疾病患病率增加之间存在显著相关性。同时国外一项流行病学调查发现室外空气污染与肾癌的发生密切相关。PM可以诱导产生氧化应激、炎症反应、免疫紊乱、DNA损伤和遗传毒性、信号通路改变等对机体产生损伤，使得癌基因和凋亡基因表达发生改变。既往大量研究主要是开展PM对肺和支气管的影响，本实验室前期也重点研究了PM对人支气管上皮细胞的影响，但关于PM对肾细胞的影响文献报道很少，因此本文应用HK-2肾细胞进行PM染毒，检测癌基因(

c-myc、c-fos、p53

)和凋亡基因(

Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2

)表达的变化，为深入探讨PM对HK-2肾细胞的毒理学作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

人肾上皮细胞(HK-2)购于上海细胞库。DMEM培养基(美国Hyclone公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，RNeasy Mini Kit(德国Qiagen公司)，基因反转录试剂盒(Prime Scrip RT Reagen kit)和反转录-PCR核酸染料检测试剂盒(SYBR Prime Script RT-PCR kit)(日本TaKaRa公司)，凋亡基因和癌基因PCR引物由上海生工合成。c-myc、c-fos、p53一抗购于美国Cell Signaling公司；Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2 和GAPDH一抗均购于美国Santa Cruz公司，二抗(羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP)购于美国Thermo Scientific公司。中流量大气采样器(TH-150C III型)购于武汉市天虹仪器有限责任公司；7500实时荧光定量PCR仪购于美国Applied Biosystems公司；垂直电泳系统(Mini-protean Tetra)购于美国Bio-Rad公司；冷CCD成像系统购于美国GE公司。

1.2 PM2.5样品制备

PM样品采集于山西省太原市山西大学校园内，本实验对采集到的吸附有PM的滤膜称质量后剪成2 cm×2 cm小块放于烧杯中，加入超纯水完全浸没滤膜，用锡箔纸密封，超声振荡30 min后取出滤膜，将PM样品悬浊液转移到干净的真空冷冻物料盘中，再次用锡箔纸密封后于-80℃冰箱冷冻24 h；用封口膜替换锡箔纸密封物料盘并在封口膜上点许多密集的小孔，于真空冷冻干燥机中干燥24 h，至PM完全干燥；无菌工作台中紫外灯灭菌2 h后用超纯水溶解干燥的PM颗粒，使之混合均匀，完成PM混悬液的制备，分装标记后于-20℃保存待用，每次使用前振荡混匀。

1.3 CCK-8法测定PM2.5对细胞存活率的影响

用含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM完全培养基在37℃、CO体积分数为5%的条件下培养HK-2细胞至稳定后消化，以每孔5×10个细胞的浓度接种到96孔板中，培养24 h后吸出培养液，利用不含血清的DMEM培养基配制终浓度为12.5、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0 和 300.0 μg/mL 的 PM悬液作为实验组，每孔加入100 μL悬液进行染毒；以不加PM的DMEM培养基孔作为对照组；不加PM和HK-2细胞的孔作为空白组。每组设置4个复孔，对细胞染毒培养24 h后弃培养液。按照CCK-8试剂盒说明书向每孔加入含10%CCK-8原液的溶液100 μL，在培养箱孵育1～4 h后用酶标仪测定吸光度

D

(450)值。利用公式：

计算出各浓度下细胞存活率，并求出PM对HK-2细胞的半数抑制浓度(IC)。

1.4 细胞培养与PM2.5染毒分组

利用DMEM培养基调节细胞浓度为4×10个/mL并接种至6孔板中，每孔加2 mL培养基进行细胞培养，待细胞覆盖率达到80%时进行PM样品染毒。本研究设置了只添加DMEM培养基的阴性对照组、终浓度分别为10和50 μg/mL的低和高剂量PM染毒组、终浓度为10 μmol/l Cr阳性对照组。每组细胞染毒后均培养24 h，染毒结束后应用实时荧光定量PCR(quantitative real-time，PCR，qPCR)和Western blot分别检测c-myc、c-fos、p53、Caspase-8、Caspase-9和Bcl-2 mRNA和蛋白的表达水平。

1.5 qPCR检测目的基因mRNA表达水平

将染毒后的HK-2细胞用PBS清洗3次，使用RNeasy Mini Kit提取各个剂量组细胞的总RNA，按基因反转录试剂盒说明书逆转录为cDNA。反应体系：5×Prime Script RT Master Mix液 4 μL，总 RNA 1 μg，加 RNase Free dHO 至 20 μL。反转录条件：37℃、15 min，85℃、5 s，4℃、10 min，-20℃冰箱保存。将逆转录产物作为模板进行PCR扩增，对目的基因mRNA水平进行定量检测。PCR反应条件为95℃预变性30 s；95℃变性5 s，55℃退火延伸30 s，共40个循环。以GAPDH作为内参，运用2公式计算目的基因的相对表达水平。目的基因PCR引物序列见表1。

表1 目的基因qPCR引物序列

1.6 Western blot检测蛋白表达水平

将染毒后的HK-2细胞用PBS清洗3次，加入适量含蛋白酶抑制剂的裂解液于冰床上裂解细胞20 min，收集细胞混悬液于EP管中，在4℃、10 000 r/min条件下离心20 min，收集上清液，按照BCA蛋白浓度定量法对收集的蛋白样品进行定量。加入5×上样缓冲液，100℃变性8 min。配制10%分离胶，5%浓缩胶，按照定性结果进行蛋白上样。SDS-PAGE凝胶电泳后，使用湿转法电泳90 min将蛋白完全转移至PVDF膜上，在TBST稀释成的5%脱脂牛奶中于室温摇床上封闭2 h，根据目的蛋白分子大小切取相应条带之后使用一抗于4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min，加入相应的二抗，于室温摇床上孵育50～60 min，随后TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min，加入ECL化学发光试剂后使用冷CCD成像系统进行显影，以GAPDH作为内参，使用Image J软件分析灰度值并计算蛋白相对表达水平。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 PM2.5样品对HK-2细胞的IC50

结果显示，当PM染毒终浓度为25.0 μg/mL时HK-2细胞存活率明显下降，与对照组比较差异有统计学意义(

P

＜0.01)，利用GraphPad Prism软件计算得到PM混悬液染毒24 h对HK-2细胞的IC为95.98 μg/mL，见图1。

图1 PM2.5染毒24 h后对HK-2细胞活力的影响

2.2 PM2.5对癌基因和凋亡基因mRNA表达的影响

qPCR结果显示，与阴性对照组(100%)比较，10、50 μg/mL PM染毒组和阳性对照(10 μmol/L的Cr)组HK-2细胞c-myc mRNA表达分别升高了106.52%、85.53%和102.83%；c-fos mRNA表达分别升高32.16%、42.28%和27.35%；p53 mRNA表达分别下降7.77%、25.07%和35.26%；Caspase-8 mRNA表达分别升高16.98%、24.05%和26.27%；Caspase-9 mRNA表达分别升高59.73%、65.90%和121.43%；Bcl-2mRNA表达分别下降40.09%、49.76%和69.73%，差异均有统计学意义(

P

＜0.01)，见表2。

2.3 PM2.5对目的蛋白表达水平的影响

Western blot结果显示，与阴性对照组相比，10、50 μg/mL PM染毒组和阳性对照(10 μmol/l的Cr)组HK-2细胞c-myc蛋白表达水平分别升高了7.64%、29.67%和24.80%，且差异均有统计学意义(

P

＜0.05)；c-fos蛋白表达水平分别升高了2.54%、18.44%和32.07%，除10 μg/mL PM染毒组外，差异具有统计学意义(

P

＜0.05)；p53蛋白表达水平分别下降了16.69%、20.40%和19.63%，差异具有统计学意义(

P

＜0.05)；Caspase-8蛋白表达水平分别升高了16.90%、28.95%和28.30%，除10 μg/mL PM染毒组外，差异具有统计学意义(

P

＜0.05)；Caspase-9蛋白表达水平分别升高11.78%、27.54%和50.78%，除10μg/mL PM染毒组外，差异具有统计学意义(

P

＜0.05)；Bcl-2蛋白表达水平分别下降了13.19%、9.47%和16.37%，差异具有统计学意义(

P

＜0.05)，见图2和3。

表2 PM2.5染毒后HK-2细胞癌基因和凋亡基因mRNA表达水平

图2 PM2.5染毒对HK-2细胞c-myc、c-fos和p53蛋白表达水平的影响

图3 PM2.5染毒对HK-2细胞Caspase-8、Caspase-9和Bcl-2蛋白表达水平的影响

3 讨论

PM由于其粒径小的特点可以吸附铅、镉、砷、铬等重金属和多环芳香烃类有机污染物，到达人的深部呼吸道从而进入血液危害人体健康。以上物质大部分具有致突变和致癌作用，对身体健康产生重大影响，但是目前关于PM对肾脏损伤的研究只有流行病学研究，缺少有关机制方面的研究。本实验室前期开展PM成分检测分析，太原市PM中存在一定浓度的 Pb、As、Cd、Ni、Cr、Mn、Al等重金属和多种PAHs，因此本文开展PM致HK-2肾细胞中部分癌基因和凋亡基因表达变化的研究，以初步探索PM对肾脏的损害机制。

c-fos

基因是一种可以对各类外界刺激在数分钟内做出反应的原癌基因，其功能是通过调节特定靶基因的方式将细胞表面被刺激的短程信号与细胞长期反应相耦连。目前许多研究认为

c-fos

基因与细胞增殖、分化及凋亡有关，在乳腺癌、结肠癌、肺癌等恶性肿瘤中均能检测到过表达的c-fos。Ishida等用c-Fos/AP-1的选择性抑制剂T-5224处理小鼠后发现，LPS注射后血清中的TNF-α和HMGB-1水平降低，血清中BUN和肌酐浓度也降低，并提高了生存率，说明抑制c-Fos/AP-1可减轻LPS诱导的肾脏病理变化，可见

c-fos

基因在LPS致肾损伤的过程中起着一定的作用，也有学者发现经过PM染毒后的大鼠肺组织和后代鼠海马组织中的

c-fos

基因表达水平升高，这与本实验中得到PM染毒后HK-2细胞中

c-fos

基因表达升高的结果一致。

c-myc

是1977年被发现的一种具有恶性转化作用的癌基因，其表达的cmyc蛋白是一种涉及细胞分化、生长、增殖以及凋亡的转录因子，并且参与调节人类15%的基因。有研究发现c-myc参与多囊肾的发生和发展，c-myc也可以通过负调节c-FLIP并增强FasL/Fas介导的凋亡途径导致促进缺血再灌注肾损伤中肾小管细胞凋亡，同时c-myc可以通过使正常细胞上皮-间质转化等来参与肾细胞的癌变过程。PM暴露会导致肺细胞内cmyc的过度表达，并且可能导致G2/M停滞且加重BEAS-2B中的DNA损伤和细胞凋亡。本研究中得到PM暴露后肾细胞中的c-myc表达水平升高，这与其他学者的研究结果相一致。肿瘤抑制基因

p53

对细胞周期、DNA损伤修复中起着重要的调控作用。本研究发现正常细胞在染毒后出现p53表达下降，p53通过调节凋亡、细胞周期停滞和自噬等细胞生物学过程，在急性肾损伤和随后的肾脏修复中起关键作用。相对于正常肾细胞，肾癌细胞中的自噬水平较高，通过诱导自噬酶体机制促进p53的降解，表达为p53表达量的下降，同时PM还通过增加DNMT3B蛋白水平来诱导p53启动子的高度甲基化并抑制其表达。研究表明，肿瘤的发生发展与启动或增强细胞凋亡机制密切相关，当细胞凋亡发生紊乱时，往往会导致多种疾病包括癌症的发生，所以凋亡往往被看作是一种抗癌过程。Zhu等发现黄芪甲素可以通过凋亡途径来抑制A498肾癌细胞的增殖，同时伴有caspase家族蛋白以及Bax蛋白的上调。Caspase-8是死亡受体通路上关键蛋白酶，它的激活和表达量的增加已被确定为许多恶性肿瘤的重要标志物。有研究报道，PM暴露能通过激活凋亡相关基因

caspase-8

等诱导细胞凋亡。Caspase-9是线粒体通路的关键蛋白酶，它的活化对整个内源性凋亡通路的激活尤为重 要。有研究发现，当细胞中的ROS水平升高时会通过各种分子级联激活Bcl-2和Bax等凋亡蛋白的表达，最终介导细胞凋亡，

Bcl-2

基因产物可以通过线粒体途径抑制细胞凋亡，使得肿瘤细胞周期延长，从而抑制肿瘤细胞的快速增殖。本研究结果表明，PM染毒后

Caspase-8

和

Caspase-9

基因的mRNA和蛋白表达水平升高，Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平降低，该结果提示PM对HK-2肾细胞凋亡基因具有一定的激活作用。由于国内外开展PM对肾细胞的毒理学研究比较少，因此，本文结果为今后深入探讨PM对肾细胞的毒理学机制提供了一定的科学依据，对于PM对多器官多系统的致癌致突变作用研究具有重要意义。