新药心脏毒性体外检测方法的建立

于志强，张华允，马中春

(宁波海关技术中心/宁波中盛产品检测有限公司，浙江 宁波 315100)

近年来，随着科学技术不断发展，新药的研发项目也随之迅速增多。新药对心脏的毒副作用是其在开发过程中被淘汰的重要原因之一。因此，新药的心脏毒性检测在新药的研发过程中尤为重要。

新药心脏毒性是指新药在相对较小的剂量和相对短的时间内对心脏生理功能产生影响或者对心肌细胞造成损伤的药效反应。能够引起心脏毒性的药物主要包括直接抑制或者损伤心肌细胞的药物，例如蒽环类的阿霉素、柔红霉素等；引起液体潴留的药物，例如噻唑烷二酮类等；烷化剂，例如环磷酰胺等；抗心力失常和钙通道阻滞剂等药物。药物对心肌细胞的毒性机制复杂，并能够引起心肌发生不可逆的损伤。但目前针对新药安全评价的检测方法主要是动物实验，不能明确人用药后的毒性症状和毒性剂量，同时不符合“3R”原则。因此寻找能够准确，快速，敏感反映出外源性化合物对心肌造成损伤的检测方法是近年来科研人员的研究重点。

本研究拟针对新药中化合物对心脏造成的毒性作用建立一项应用人源心肌细胞的体外检测方法，以期为新药研发提供一种准确、便捷的检测手段。为新药的开发、临床前实验和质量检测过程提供有效手段和技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人源心肌细胞(hPSC-CMs)，购自宁波医诺生物科技有限公司。他莫昔芬和氟哌利多均购自Sigma公司。美国食品及药物管理局(U.S.Food and Drug Administration，FDA)的 Comprehensive

in vitro

Proarrhythmia Assay(CiPA)项目将他莫昔芬归类为低风险类别，将氟哌利多归类为中风险类别；DMEM/F12培养基、胎牛血清均购自Gibco公司；胰蛋白酶购自Hy-Clone公司。

1.2 实验仪器

96孔板购自Costar公司；CO培养箱购自德国Binder公司；倒置显微镜购自日本Olympus公司；超净工作台购自Biox公司；超速离心机购自德国Hermle公司；CardioExcyte96购自德国Nanion公司。

1.3 心肌毒性测定

将hPSC-CMs复苏，传代培养3 d后接种于提前用铺板液包被好的电极矩阵96孔板中，hPSC-CMs培养基维持培养，由于存在边缘效应和大概30%左右的损失率(包含接种后不跳或者基线不稳)，所以培养板在设计实验的时候只选择中间的孔。如果中间有部分不符合要求的孔可以从外圈选择，这样可以保证实验的统一性。48 h后按每孔200 μL全部置换细胞培养液。

实验分为加药实验组和不加药对照组。加药实验组对于每个测试样本，设置3个浓度梯度，每个浓度设置3个复孔，他莫昔芬浓度分别为0.33、1和3 μmol/mL，氟哌利多分别为0.11、0.33和1 μmol/mL。不加药对照组给予等量的细胞培养液。加药后1、2、3、6、9、12、18、24、30、36、42 和 48 h 采用CardioExcyte96设备检测心肌细胞的场电位时程(field potential duration，FPD)和收缩频率。场电位时程主要是指可兴奋组织或细胞受到阈上刺激时，在静息膜电位基础上发生的快速、去极化引发的动作电位，其中动作电位从0相至3相结束的时程称为动作电位时程。心脏收缩的频率也称之为安静时心脏跳动的次数，简称为心率。心率与年龄有直接关系，年龄越小，由于新陈代谢比较快，交感神经的活性比较高，心脏收缩的频率较快。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行数据处理，计算出各组数据的平均数和方差，在Excel中输入FPD(Max)和收缩频率数据，以FPD(Max)和收缩频率值为纵坐标，时间含量为横坐标建立直角坐标系，绘制FPD(Max)和收缩频率随时间变化曲线。

2 结果

2.1 他莫昔芬对心肌毒性测试结果

2.1.1 他莫昔芬对hPSC-CMs细胞FPD的作用

当添加3 μmol/mL的他莫昔芬处理3 h时，FPD(Max)数值降为0，结合收缩频率数据可知出现心肌细胞停跳现象，18 h时，心肌细胞复跳。对照组0～48 h FPD(Max)数值在0.179～0.264范围内。1和0.33 μmol/mL他莫昔芬的FPD值趋势与对照组基本保持一致(图1)。

图1 他莫昔芬对hPSC-CMs细胞FPD的作用曲线图

2.1.2 他莫昔芬对hPSC-CMs收缩频率的作用

当添加3 μmol/mL的他莫昔芬处理3 h时，结合FPD(Max)数据，出现心肌细胞停跳现象，反应为收缩频率数值降为0，18 h时，心肌细胞复跳。对照组收缩频率在64.86～73.82次/分钟范围内。1 μmol/mL他莫昔芬处理下的心肌细胞收缩频率低于对照组；0.33 μmol/mL他莫昔芬处理下的心肌细胞收缩频率趋势与对照组基本保持一致(图2)。

图2 他莫昔芬对hPSC-CMs收缩频率的作用曲线图

2.2 氟哌利多心肌毒性测试结果

2.2.1 氟哌利多对hPSC-CMs FPD的作用

心肌细胞FPD值对氟哌利多具有浓度依赖性，浓度越高，FPD(Max)数值越大，即QT间期长度越长。对照组0～48 h FPD(Max)数值在0.179～0.243范围内。24 h时进行全换液，换液后各浓度与对照组基本一致(图3)。

图3 氟哌利多对hPSC-CMs FPD的作用曲线图

2.2.2 氟哌利多对hPSC-CMs收缩频率的作用

心肌细胞收缩频率值对氟哌利多具有浓度依赖性，浓度越高，收缩频率数值越小，结合FPD(Max)数据，氟哌利多具有降低心肌细胞收缩频率，延长QT间期的作用。对照组收缩频率在63.49～76.93次/分钟范围内。24 h时进行全换液，换液后各浓度处理的心肌细胞均有一定程度的恢复，但氟哌利多0.33和1 μmol/mL处理组收缩频率低于对照组，氟哌利多0.11 μmol/mL处理组的收缩频率与对照组基本保持一致(图4)。

图4 氟哌利多对hPSC-CMs收缩频率的作用曲线图

3 讨论

现阶段，新药的心脏毒性主流检测方法是应用动物模型。动物模型不仅检测成本高、检测周期长、效率低，并且与人体存在基因和生理等方面的种属差异。例如，正常人体心脏搏动频率为60～100次/分钟，而小鼠静息状态下的心率是人类的10倍，因此其在预测和评价药物的心脏毒性反应方面必然与人体存在较大偏差。因此进行新药评价最为准确的方法就是采用人体心脏作为实验对象，可以最真实地反映心脏对于候选药物的响应情况，然而这在药物临床前研究阶段是不可能实现的。

本研究主要应用hPSC-CMs建立新药心脏毒性体外检测方法。应用CiPA项目认定的低风险化合物他莫昔芬和中风险化合物氟哌利多作用于hPSC-CMs模型，通过检测两种化合物不同浓度作用hPSC-CMs后的FPD和收缩频率的变化来判断其心脏毒性风险程度是否符合CiPA项目的认定标准。本研究发现，他莫昔芬只有在高浓度时才能对hPSC-CMs的FPD和收缩频率产生影响，使心肌细胞出现停跳现象；心肌细胞FPD值和收缩频率对氟哌利多均有浓度依赖性，浓度越高，FPD(Max)数值越大，即QT间期长度越长，收缩频率数值越小。上述结论与CiPA项目的认定标准相符，证明该方法可以准确评价低风险化合物他莫昔芬和中风险化合物氟哌利多对hPSC-CMs模型的毒性作用。

本研究建立的新药心脏毒性体外检测方法仍需后续通过检测CiPA项目认定的多种低、中和高风险化合物来进一步验证其可靠性、准确度和灵敏度。本研究的后续研究将进一步优化条件并应用建立的新药心脏毒性体外检测方法对待检样品进行检测，同时寻找多种新药来对其心脏毒性进行评价。