基于Nrf2信号通路探讨刺梨对过度训练大鼠骨骼肌氧化应激损伤保护的机制

张帅军 唐月 张大 杜旭辉 张锦

摘要：目的：探討刺梨介导核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）信号通路对过度训练大鼠骨骼肌氧化应激损伤防护的分子机制。方法：SPF级SD大鼠45只，随机分为安静对照组（C组），大强度运动组（HT组）、低剂量刺梨大强度运动组（L-HT组）、高剂量刺梨大强度运动组（H-HT组）。以跑台运动创建过度训练模型，L-HT、H-HT组分别以100 g/kg/d和200 g/kg/d的剂量灌胃刺梨原液，C组、HT组灌胃等剂量的生理盐水，6周大强度跑台运动，运动结束后次日处死，取血清和腓肠肌，分别测定各组大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）的水平、组织中Nrf2通路相关蛋白Nrf2、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）、血红素氧合酶1（HO-1）和凋亡蛋白B淋巴细胞瘤因子-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）的相对表达水平（/SymbolbA@-actin）。 结果：1）与C组相比，HT组血清中GSH浓度降低、SOD活性下降以及MDA含量增多（P<0.01），组织中Nrf2通路相关蛋白Nrf2表达水平降低（P<0.05），Keap1没有显著性差异（P>0.05）、HO-1表达水平下降（P<0.05），Bcl-2表达水平下降（P<0.05），Bax表达升高（P<0.05），Bcl-2/Bax值下降（P<0.05）。2）与HT组相比，L-HT、H-HT组血清中GSH浓度上升、SOD活性增强以及MDA含量降低（P<0.05或P<0.01），组织中Nrf2通路相关蛋白Nrf2、HO-1表达水平升高（P<0.05或P<0.01），Keap1表达水平没有明显变化（P>0.05），Bcl-2表达水平升高（P<0.05），Bax表达下降（P<0.05），Bcl-2/Bax值增加（P<0.05）。结论：补充刺梨可介导Nrf2信号通路上调Nrf2、HO-1蛋白的表达，发挥抗氧化应激作用，进而缓解过度训练所致的大鼠骨骼肌氧化应激和过度凋亡，保护骨骼肌结构或功能的稳定。

关键词：刺梨;过度训练;Nrf2信号通路;氧化应激

中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1006-2076（2021）03-0097-08

Protection mechanism of rosa roxburgh against oxidative stress injury of skeletal muscle in overtraining rats based on Nrf2 signal pathway

ZHANG Shuaijun1， TANG Yuemei1， ZHANG Dading1， DU Xuhui2， ZHANG Jin2

1.College of Science and Technology，Gannan Normal University， Ganzhou 341000， Jiangxi; 2. The First People's Hospital of Pingdingshan， Pingdingshan 467000， Henan， China

Abstract：Objective： To explore the molecular mechanism of rosa roxburgh mediated nuclear factor E2-related factor 2 （NRF 2） signaling pathway in protecting skeletal muscle from oxidative stress injury in overtrained rats. Methods： 45 SPF SD rats were randomly divided into quiet control group （C group）， high intensity exercise group （HT group）， low-dose Rosa high intensive exercise group （L-HT group） and high-dose rosa high intensive exercise group （H-HT group）. The overtraining model was established by treadmill exercise. The L-HT and H-HT groups were given 100g/kg/d and 200g/kg/d of rosa stock solution respectively， and the C and HT groups were given the same dose of physiological saline. After 6 weeks of intensive treadmill exercise， they were killed the next day after exercise， and serum and gastrocnemius were collected. The levels of superoxide dismutase （SOD）， glutathione （GSH） and malondialdehyde （MDA） in serum， Nrf2 pathway related protein， Kelch-like epichlorohydrin related protein -1（Keap1）， heme oxygenase-1（HO-1）， apoptosis protein B lymphocyte tumor factor -2（Bcl-2） and Bcl-2 related X protein in tissues were measured respectively Results： 1） Compared with group C， the concentration of GSH in serum， SOD activity and MDA content in HT group decreased （P<0.01）， and the expression level of Nrf2 pathway related protein in tissues decreased （P<0.05）， but there was no significant difference in Keap1 （P>0.05）， HO-1 expression level decreased （P<0.05），Bcl-2 expression level decreased （P<0.05）; Bax expression level increased （P < 0.05）; Bcl-2/Bax expression level increased （P<0.05）. 2） Compared with HT group， GSH concentration in serum， SOD activity and MDA content in L-HT and H-HT groups increased （P<0.05 or P<0.01）， and the expression level of Nrf2 and HO-1 in tissues increased （P<0.05 or P<0.01）， but the expression level of Keap1 did not change significantly （P>0.05）. Conclusion： Supplementing rosa roxburgh can mediate Nrf2 signaling pathway to up-regulate the expression of Nrf2 and HO-1 proteins and exert the effect of anti-oxidative stress， thereby alleviating oxidative stress and excessive apoptosis in rat skeletal muscle caused by over-training， and protecting the stability of skeletal muscle structure or function.

Key words：rosa roxburgh; overtraining; Nrf2 signal pathway; oxidative stress

氧化应激（Oxidative Stress，OS）是体内氧化与抗氧化失衡的一种状态，是因自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS）及其代谢物增加或抗氧化机制减弱而引起炎症反应。氧化应激下，组织细胞内的核酸、蛋白质和脂质等生物分子交联、灭活引起膜损伤以及一些生理生化过程的紊乱。刺梨（Rosa）系蔷薇科落叶灌木植物，别名缫丝花、送春归等，盛产于我国西南省区，刺梨果富含维生素C、大量维生素B1、B2、E、K等多种微量元素和SOD以及多糖、酸类、酚类和黄酮类衍生物等，具有抗炎症、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤和提升免疫能力等多种功能。随着对刺梨开发研究的深入，刺梨在食品和药品等方面的重要性越来越凸出，其抗氧化性、抗炎症的功能成为近几年来研究的热点之一。对近年来刺梨研究的成果进行收集整理，发现其抗氧化和抗炎症的研究几乎都是从其所含营养成分方面进行的，而通过信号途径研究刺梨抗氧化应激的文章屈指可数，说明在细胞信号途径方面还存在着明显不足。Nrf2信号通路是迄今为止发现最为重要的内源性抗氧化应激通路，对细胞代谢活动起重要调节作用，参与组织细胞抗氧化炎症、衰老、凋亡等病例生理过程。因此本研究拟通过建立过度训练的大鼠模型，通过不同剂量的刺梨补剂，检测血清中氧化与抗氧化应激指标，并结合组织内Nrf2信号通路相关蛋白表达以及凋亡水平，探讨刺梨介导Nrf2信号通路对过度训练所致的骨骼肌氧化应激损伤的保护机制，以期为刺梨作为食品抗氧化剂或运动功能性食品的进一步开发提供理论依据。

1材料与方法

1.1动物、材料与试剂

SPF级SD大鼠45只（3月龄），体质量（236.78±1.21）g，购自江西中医药大学动物实验中心，生产许可证号：SCXK（赣）2018-0003，饲养于（22±2）℃、相对湿度（60±5）的环境中，自由饮食，喂食国家标准啮齿类动物饲料，饮用蒸馏水，正常昼夜节律。

刺梨，采用贵州天刺力食品科技有限责任公司生产的精制刺梨原液。

SOD试剂盒（50T/24S）、GSH試剂盒（100T/96S）、MDA试剂盒（100T/96S）;HO-1（48T）、Keap1（96T）、Bcl-2（48T）、Bax（48T）试剂盒;磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline，PBS）、放射免疫沉淀法裂解缓冲液（Radio immunoprecipitation assay lysis buffer，RIPA裂解液）、哺乳动物组织总蛋白提取试剂盒（AR0146）、RNA提取试剂盒、cDNA转录试剂盒（Tip Green qPCR Super Mix）、荧光定量试剂盒（RR820A）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白缓冲液5x（AR1112）、5牛血清白蛋白封闭液（Bovine serum albumin，BSA，AR0004）、增强型化学发光（Enhanced chemiluminescent，ECL）底物（AR1170）、硝酸纤维素膜（Nitrocellulose membrane，NC）、兔抗大鼠Nrf2抗体（sc-722）、兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（BA2913）、辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）-羊抗兔IgG（BA1054）。

1.2仪器与设备

JD-PT动物实验跑台（上海继德教学实验器械厂），CL-H120电子天平（上海亚津电子科技有限公司），TGL-16G-A低温高速离心机（上海安亭化学仪器有限公司），TENLIN-C型电动匀浆器（江苏天翎公司），EYELA振荡器MMS-120H（杭州恒流科技有限公司），FD-1型冷冻干燥机（北京博医康技术公司），LD-96A酶标仪、莱恩德荧光定量PCR反应仪（山东莱恩德智能科技有限公司公司），UC0102核酸扩增仪（杭州优思达生物技术有限公司），KH-Q320型切片机（湖北孝感阔海医疗科技有限公司），YKY-1100型荧光显微镜（基恩士 （中国） 有限公司），SP-9CA型生物显微镜（上海光学仪器厂），WD-9413B型凝胶成像分析系统、DYCZ-40K转印电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。

1.3方法

1.3.1灌胃溶液的配制

刺梨精制原液纯度为98，参考何诚动物实验学动物灌胃的标准，大鼠灌胃剂量按照200 mg/kg/d的标准以10 ml/kg灌胃。

1.3.2动物模型的建立

45只SD大鼠，随机选取8只作为安静对照组（C组，8只），剩余37只以10 m/min，坡度0°，10 min/d的运动负荷进行筛选，剔除运动能力较差的大鼠4只，将剩余33只大鼠随机分为大强度运动组（HT组，11只）、低剂量刺梨大强度运动组（L-HT组，11只）、高剂量刺梨大强度运动组（H-HT组，11只）。实验过程中，由于训练强度过大以及其他原因，造成运动大鼠的部分死亡，最终C组8只，HT组7只，L-HT组10只，H-HT组10只。L-HT、H-HT组分别以100 g/kg/d和200 g/kg/d的剂量灌胃刺梨精制原液，C组、HT组每天以等体积的生理盐水灌胃，每天运动前2 h灌胃一次，干预6周。运动方案采用改良后的6周递增负荷跑台训练，具体方案如表1所示。

1.3.3血液标本采集和骨骼肌组织的提取

6周末次运动后，次日上午10：00各组大鼠用10的巴比妥腹腔注射麻醉，尾静脉取血3 ml，置于抗凝管内，4℃、3 000 r/min，离心10 min，分离血清，分装置于-20℃冰箱保存待测。断头处死各组大鼠，即刻取腓肠肌，置于冰浴中，剔除脂肪及周围的结缔组织，用预冷的生理盐水冲洗血渍，待滤纸吸干后，各组用电子天平称重1g，按照1∶4的比例（肌肉质量（g）：PBS体积（mL）=1∶4的比例加入PBS介质）用眼科剪剪碎置于玻璃匀浆管，加入4 ml匀浆介质，电动匀浆器匀浆，4℃、6 000 r/min、10 min，取上清液标记分装，置于-80℃冰箱保存。

1.4指标测试

1.4.1大鼠血清中氧化应激指标的测定

取待测血清，测定血清中氧化应激指标变化。微量酶标法测定GSH的浓度，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定SOD的活性，试剂盒购于南京建成生物工程研究所，按试剂盒说明步骤进行测试。

1.4.2大鼠骨骼肌组织中Nrf2信号通路相关蛋白表达的测定

取待测组织液，在RIPA裂解液中加入蛋白酶抑制剂，振荡器摇匀置于冰水浴中沉淀。用二辛可宁酸 （bicinchonininc acid，BCA）法测各组待测液蛋白浓度，并稀释至相同浓度，蛋白定量后加入上述混合液，100℃煮沸5 min，按照4∶1的体积比例加入SDS-PAGE蛋白上清液5 x，分离样品并转膜，用TBST洗涤3次后，用牛清蛋白封闭2 h，再用TBST洗涤3次，加入二抗后在室温下孵育，用TBST洗脱二抗，用ECL试剂显影，以β-actin为内参，制作电泳凝胶，用Western印迹法测定组织中Nrf2、Keap1、HO-1蛋白的相对表达水平，用WD-9413型凝胶成像系统进行显影。

1.4.3骨骼肌组织Nrf2信号通路中细胞凋亡相关蛋白的测定

取待测组织液，在RIPA裂解液中加入蛋白酶抑制剂，摇匀置于冰水浴中沉淀。用Trizole法提取组织液中总RNA，每个样本以2 μgRNA作为初始模板，反应条件：37℃、15 min，85℃、5 min，4℃、10 min保持。以合成的cDNA为模板，以β-actin为内参，配置20 μl的总反应体系，每个样本检测3个复孔，用实时荧光定量PCR系统进行荧光定量，反应条件为预变性95℃、30 s，PCR反应95℃、5 s， 60℃、30 s，40个循环。根据基因序列设计特异性引物，应用cDNA合成试剂盒在核酸扩增仪上进行反转录成cDNA，进行RT-PCR检测细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达，以2-△△Ct进行数据分析。基因引物序列如表2所示。

1.5数据处理与分析

实验数据以x±s表示，采用SPSS20.0软件进行数据分析，组间差异使用单因素方差分析（One way ANOVA），实验用GraphPad Prism8.0软件绘图分析，P<0.05为显著性差异，P<0.01为异常显著性差异。

2实验结果与分析

2.1大鼠血清中氧化应激指标的测定

正常机体存在着各种抗氧化酶（SOD、CTA、GSH-PX）、小分子抗氧化剂（GSH、VC、VE）等，形成了重要的防御体系以对抗ROS的损伤。通过对各组大鼠骨骼肌组织中GSH浓度、SOD活性以及 MDA含量的检测，结果显示，与C组相比，HT组GSH浓度降低、SOD活性下降以及MDA含量增多等都呈现异常显著性差异 （P<0.01）;与HT组相比，L-HT组GSH浓度上升、SOD活性增强以及MDA含量降低等都呈现显著性差异 （P<0.05），H-HT组GSH浓度增高、SOD活性增强以及MDA含量降低等呈现异常显著性差异 （P<0.01）;与L-HT组相比，H-HT组SOD活性增强以及MDA含量降低等呈现异常显著性差异（P<0.01）， GSH浓度没有统计学差异（P>0.05），见表3。

2.2大鼠骨骼肌组织中Nrf2信号通路相关蛋白表达的测定

Nrf2是Nrf2信号通路抗氧化应激反应的关键转录因子，氧化应激下，调控Nrf2和Keap1的结合态，实现抗氧化酶的表达。通过对各组大鼠骨骼肌组织中Nrf2信号通路相关蛋白Nrf2、Keap1和HO-1的检测，结果显示，与C组相比，HT组Nrf2表达水平降低具有显著性差异（P<0.05），Keap1表达水平没有统计学差异 （P>0.05），HO-1表达水平降低有显著性差异（P<0.05）;与HT组相比，L-HT组Nrf2表达水平升高有显著性差异（P<0.05），Keap1表达水平没有显著性差异（P>0.05），HO-1表达水平升高有显著性差异（P<0.05）;H-HT组Nrf2表达水平升高有异常显著性差异（P<0.01），Keap1表达变化没有统计学差异（P>0.05），HO-1表达水平升高有異常显著性差异（P<0.01）;与L-HT组相比，H-HT组Nrf2表达水平升高有显著性差异（P<0.05），Keap1表达水平没有统计学差异（P>0.05），HO-1表达水平升高有显著性差异（P<0.05）（见图1）。

2.3大鼠骨骼肌组织中细胞凋亡相关蛋白的测定

细胞凋亡是多因素、多阶段和多基因严格控制的过程，涉及到诱导凋亡相关因素作用下启动信号转导，凋亡相关基因接受死亡信息后按预定程序启动合成执行凋亡所需的多种酶，通过级联反应降解底物，出现凋亡特征性的形态和生化改变。Bcl-2家族蛋白被视为调节细胞凋亡的开关，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax之间的相互作用，决定了细胞死亡的阈值。通过对各组大鼠骨骼肌组织中细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax和Bcl-2/Bax值的检测，结果显示，与C组相比，HT组Bcl-2表达水平下降，呈现异常显著性差异（P<0.01），Bax表达升高，呈现异常显著性差异（P<0.01），Bcl-2/Bax值下降，呈现异常显著性差异（P<0.01）;与HT组相比，L-HT组Bcl-2表达水平升高呈现显著差异性（P<0.05），Bax表达降低呈现显著差异性（P<0.05），Bcl-2/Bax值增加，有显著差异性（P<0.05）;H-HT组Bcl-2表达水平升高呈现异常显著性差异（P<0.01），Bax表达降低呈现显著差异性（P<0.01），Bcl-2/Bax值升高有异常显著性差异（P<0.01），与L-HT组相比，H-HT组Bcl-2、Bax表达水平没有统计学差异（P<0.01），Bcl-2/Bax值升高有显著性差异（P<0.05）（见图2）。

3讨论

3.1过度训练对大鼠骨骼肌氧化应激损伤的影响

应激是指机体在受到一定强度的刺激作用时，所出现的全身性非特异性适应反应。生理状态下，体内自由基的生成保持在低浓度动态平衡之中。SOD是生物体内对抗氧自由基最重要的抗氧化酶，研究证实SOD活性越高，机体抗氧化能力就越强。韩春华等研究表明，急性运动组大鼠骨骼肌线粒体内ROS水平及SOD量与对照组相比明显升高。MDA是含双键的脂肪酸过氧化生成的产物，能与蛋白质、磷脂和核酸的胺交联和聚合，产生过氧化连锁反应。机体内MDA的量与脂质过氧化成正相关，测定MDA含量可间接反应运动时自由基的生成及其毒性作用的程度。高超等研究显示，急性运动训练导致小鼠骨骼肌损伤，骨骼肌组织中MDA的含量明显升高。朱洪竹等研究表明，递增大强度运动造成大鼠骨骼肌损伤，与对照组相比运动组血清MDA的含量升高异常显著。GSH是体内重要的抗氧化剂之一，在清除自由基及衍生物的毒性中起主要作用。Corbucci研究报导，马拉松运动员跑完全程后股外肌GSH/GSSG比值由运动前16倍降低到运动后的3.26倍，证明肌肉中进行了大量的抗氧化过程。Antonello等报导，小鼠进行长时间力竭运动，肌肉中的GSH和GSSG的总量降到运动前水平的60以下。本研究中大鼠6周跑台训练后，组织匀浆中SOD活性、MDA含量、运动组显著高于对照组，GSH浓度显著低于对照组，与以往的研究具有一致性，说明实验建模成功，即实验设计的运动方案是可行的。

3.2过度训练对大鼠骨骼肌Nrf2信号通路相关蛋白表达的影响

Nrf2信号通路是多细胞生物最为重要的内源性抗氧化应激通路。运动对Nrf2信号通路相关蛋白表达影响的研究较多，胡戈等研究显示，长期大强度运动诱导大鼠心肌细胞凋亡中，大强度训练组Nrf2信号通路相关蛋白Nrf2的表达与对照组无显著差异（P>0.05），但HO-1表达与对照组相比显著下降（P<0.05）。郭新明等研究显示，急性大强度运动导致大鼠机体产生氧化应激的同时，可明显降低骨骼肌抗氧化通路关键蛋白Nrf2的相对表达量，也对抗氧化酶HO-1具有刺激作用。Grilly等研究表明，6周跑台训练后WT大鼠骨骼肌Nrf2转录活性提高。李锋等研究显示，长期大强度运动诱导的大鼠肾脏损伤中，大强度运动组肾脏细胞凋亡水平及Bax蛋白表达与对照组相比明显增强（P<0.01），Bcl-2蛋白表达明显减少（P<0.01），Nrf2蛋白表达变化没有统计学差异（P>0.05），但HO-1蛋白表达减少（P<0.05）。Muthusamy等研究发现，急性运动导致WT大鼠心肌组织中Nrf2核积累和Nrf2-ARE结合活性显著增加。上述研究结果不尽相同，主要是研究中采用的运动方式不同，以及运动的时间和强度大小不同。本研究中大鼠6周跑台训练后，与C组相比HT组肌组织中Nrf2表达水平降低，HO-1的表达量有显著性差异，抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平下降，促凋亡蛋白Bax表达水平升高，Keap1表达水平没有变化，与已有长期大强度训练导致Nrf2信号通路相关蛋白表达的研究结果具有较好的一致性。其原因可能是长期大强度训练，引起大鼠机体氧化应激水平过高，出现了抗氧化抑制现象。

3.3刺梨补剂对过度训练大鼠骨骼肌氧化应激损伤影响的分析

刺梨因富含VC、VE、VB族及微量元素、SOD、黄酮、多糖、多酚及多种人体必须氨基酸等营养素，大量的研究证实了刺梨在抗氧化应激方面具有较好的作用。夏星等研究表明，刺梨提取物能显著增强小鼠的抗疲劳和耐缺氧能力，增加机体糖原储备;陈庆等研究表明，刺梨多糖具有抗肿瘤和抗氧化活性的功能;杨江涛等研究表明，刺梨多糖可剂量依赖性地提高衰老小鼠体内抗氧化能力;张晓玲等研究表明，刺梨黄酮能有效保护胰脏免受四氧嘧啶氧化损伤，预防糖尿病;许梦捷等研究表明，刺梨多酚对小鼠黑色素瘤B16细胞增殖和酪氨酸酶活性均有一定的抑制作用。本研究中大鼠6周跑台训练后，与HT组相比，L-HT、H-HT组都表现出较好的抗氧化性，SOD活性、GSH浓度表达水平升高，MDA含量下降，且H-HT组比L-HT组在抗氧化方面表达效果更明显，与已有的刺梨抗氧化应激研究具有一致性，再次验证了刺梨的抗氧化應激损伤作用，同时还佐证了在一定范围内，刺梨补剂量的多少与氧化应激效果呈负相关。

3.4刺梨补剂对过度训练大鼠骨骼肌Nrf2信号通路、细胞凋亡相关蛋白表达的影响

黄酮、多酚等成分是刺梨的有机组成部分，以刺梨为研究对象，通过介导Nrf2信号通路发挥作用的研究较少，但以黄酮（芦丁、槲皮素）、多酚类（茶多酚）物质研究Nrf2信号通路、细胞凋亡的研究较多。王斌等研究表明，芦丁可上调Nrf2与HO-1蛋白表达水平，减轻梗阻性肾病大鼠肾脏氧化应激损伤;李阳等研究表明，低、高剂量槲皮素都能上调Nrf2以及下游抗氧化酶HO-1的蛋白含量和mRNA表达量，减轻T2DM大鼠胰腺氧化损伤，改善胰岛素抵抗;马涛等研究表明，茶多酚通过上调糖尿病肾病小鼠肾组织中Nrf2 、HO-1蛋白表达水平，减少氧化应激，保护肾脏;院慧芳等研究表明，刺梨黄酮通过下调Bax引起的心肌细胞凋亡作用，进而发挥心肌细胞的保护作用;陈辉等研究表明，刺梨黄酮通过下调CHF大鼠心肌组织中Integrinβ1和凋亡相关蛋白表达，对心脏具有保护作用。本研究中大鼠6周跑台训练后，与HT组相比，L-HT、H-HT组信号通路相关蛋白Nrf2、HO-1表达水平升高，有显著性差异，且H-HT组比L-HT组在Nrf2、HO-1表达方面效果更明显;细胞凋亡相关蛋白Bcl-2表达水平升高、Bax表达水平下降，Bcl-2/Bax比值增大，有显著性差异，且H-HT组比L-HT组在Bcl-2/Bax值增加上更明显，说明刺梨可激活Nrf2信号通路相关蛋白Nrf2、HO-1的表达，且在一定范围内刺梨补剂量的多少与Nrf2信号通路相关蛋白Nrf2、HO-1的表达呈正相关，同时还证实了刺梨可降低细胞凋亡水平。

3.5刺梨介导Nrf2信号通路对过度训练大鼠骨骼肌氧化应激损伤的保护机制

Nrf2信号通路是机体重要的内源性抗氧化应激通路，Nrf2是Nrf2信号通路中的一种关键蛋白，安静状态下Nrf2与Keap1结合，无活性，同时通过Keap1蛋白锚定在肌动蛋白细胞骨架上，使Nrf2持续泛化并被蛋白降解，保持细胞的酶类和抗氧化物處于基础表达水平。Nrf2属于CNC转录因子家族成员，具有高度保守的碱性亮氨酸拉链结构，有6个功能区，分别为Neh1到Neh6，Neh1区中有一个亮氨酸拉链结构bzip，bzip与小Maf蛋白形成异二聚体，是Nrf2识别ARE上DNA基序的启动子。Neh2区是Nrf2与Keap1结合区，N端包含了7个与泛素结合的赖氨酸残基，对Nrf2的降解起负向调控作用。Neh3的C端是Nrf2转录必不可少的识别子，Neh4、Neh5位于Neh1和Neh2之间，是两个独立的激活区，与共激活因子CREB结合蛋白＼结合，对Nrf2目标基因转录活性激活。Keap1有NTR、BTB、IVR、DGR、CTR 5个结构域，其中DGR区含6个双链甘氨酸重复片段，是Neh2、肌动蛋白结合的位点。BTB区与Keap1形成蛋白二聚体，与IVR具有联动作用。IVR区富含半胱氨酸，能与酚羟基、自由基和ROS发生反应，引起自身构变，导致Keap1变构。抗氧化元件位于抗氧化酶等保护性基因5′端的启动序列上，是特异的DNA启动子结合序列，能够启动Ⅱ相解毒酶和抗氧化蛋白的表达。

刺梨在基于Nrf2信号通路的抗氧化应激反应中具有级联效应。其机理可能为，刺梨中的黄酮、多酚类分子多以酚羟基形式存在于刺梨中，酚羟基可以直接修饰IVR结构域中的半胱氨酸残基，引起IVR发生变构，与BTB和Keap1形成的二聚体蛋白发生联动作用，启动DGR区的甘氨酸重复片段局部碱基的调整，引起DGR结构域变化，Neh2与Keap1亲和力下降，Neh2与Keap1解离，进入核内，通过 Neh1上的bzip与小Maf蛋白形成的二聚体，在Neh3 C端的监视下，识别位于SOD、GSH-S-PX等保护性基因5′端的启动序列（5-GAGTCACAGTGAGTCGGCAAAATT-3）上的抗氧化元件，与CBP结合，对Nrf2目标基因转录活性激活，诱导HO-1表达增加。同时Nrf2还通过与Bcl-2基因启动子反向链上的核苷酸-3 148和核苷酸-3 140之间的抗氧化反应元件结合，上调抗凋亡蛋白Bcl-2和下调促凋亡蛋白Bax的表达，减少细胞凋亡，缓解氧化应激损伤。

4结论

6周大强度跑台训练可加剧大鼠骨骼肌氧化应激反应和细胞凋亡，引起骨骼肌损伤;刺梨具有抗氧化应激反应和降低细胞凋亡水平等作用。运动期间的刺梨补充可通过介导Nrf2信号通路上调Nrf2和HO-1蛋白的表达，发挥抗氧化应激作用，同时刺梨补给量与Nrf2信号通路介导的抗氧化应激效应方面具有正相关性。

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