加味逍遥片中福美双和代森锰锌残留量气相色谱法的建立

屈浩然，卢建秋，孙 巍，王 莹，金红宇，马双成

（1中国食品药品检定研究院，北京 100050；2北京中医药大学，北京 100029；3天士力医药集团股份有限公司，天津 300410）

0 引言

二硫代氨基甲酸酯类农药是世界范围内广泛使用的一类保护型杀菌剂[1]，按结构主要分为2类，一类是二烷基二硫代氨基甲酸酯类，即常见的福美类；另一类是亚烷基双二硫代氨基甲酸酯，即常见的代森类[2]。经对中药材种植基地的调研发现福美双在中药材种植过程中被广泛、大量和定期使用[3-4]，如代森锰锌常用于人参黑斑病的防治[5]以及大黄等药材中霉霜病、根腐病的防治[6]，福美双可用于黄瓜中霜霉病的防治[7]。研究表明代森类农药可以干扰动物的生殖和内分泌系统[8]，而福美双干扰菌的有丝分裂中纺锤体的形成[9]，此类农药具有神经毒性和生殖毒性。目前的研究报道大多集中于水果[10]、蔬菜[11]、茶叶[12]、烟草[13]等基质中二硫代氨基甲酸酯类农药残留检测的报道。然而已有研究表明在太子参[14]、枸杞[15]等中药材放置过程中常使用二硫代氨基甲酸酯类农药[16]，但目前尚缺少中药材及中药制剂中该类农药残留量的检测方法。此外中药材在出口欧洲国家及美国时，由于在《美国药典》与《欧洲药典》中明确规定了草药中69种农药（116种化学单体）的残留限量检查，其中即包括二硫代氨基甲酸酯类农药[17]，规定其残留量不超过2.0 μg/kg，因此，建立中药材及中药制剂中福美双残留量的检测方法，对指导该类农药的合理使用和保障用药安全具有重要意义。

本研究以加味逍遥片为研究对象，探索建立二硫代氨基甲酸酯类的检测方法。加味逍遥片通常由柴胡、白芍、当归、甘草、茯苓、薄荷、牡丹皮组成[18]，生产厂家不同其处方及制备工艺略有差异，常用于治疗乳腺增生、输卵管阻塞、更年期综合征等，有舒肝解郁，活血调经等功效[19]。本研究中涉及的加味逍遥片由天津天士力医药集团生产，主要由当归、柴胡、白芍、白术、茯苓、甘草这6种药材组成。农药指标选择二硫代氨基甲酸酯类中常用农药代森锰锌和福美双作为检测指标，先采用HCl-SnCl2溶液将其还原为二硫化碳（CS2）后，再使用GC-FPD进行检测，为加味逍遥片中二硫代氨基甲酸酯类农药的监控提供方法参考。在对加味逍遥片中农药检测的同时，还对其生产过程中对应的药材及中间提取物进行检测，以探索此类农药在生产制备过程中的转移情况，为日常生产的风险监控提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与药品

本实验所用仪器为岛津气相色谱仪GC2010，FPD火焰光度检测器（日本岛津公司）。试剂为甲酸、甲酸铵（LCMS级，Thermo Fisher公司），乙腈、丙酮（色谱纯，Thermo Fisher公司），蒸馏水（屈臣氏）。标准品为代森锰锌（来源于Dr.Ehrenstorfer，标示纯度74.0%）、福美双（来源于Dr.Ehrenstorfer，标示纯度97.5%）。加味逍遥片及其生产过程中的药材及提取物均由天津天士力集团提供。

1.2 试验设计

1.2.1 对照溶液配制

（1）代森锰锌对照溶液

精密称取代森锰锌对照品5 mg，加吡啶超声使其溶解，并定容至10 mL，摇匀。精密量取1 mL于25 mL容量瓶中，加水稀释并定容至25 mL，即得代森锰锌对照溶液（每1 mL含代森锰锌15.096 μg）。

（2）福美双对照溶液

精密称取福美双对照品5 mg，加N,N-二甲基甲酰胺溶液5 mL使其溶解，加水稀释至10 mL，摇匀。精密量取1 mL于25 mL容量瓶中，加水稀释至25 mL，即得福美双对照溶液（每1 mL含福美双19.852 μg）。

（3）CS2对照溶液

取CS2对照品，加异辛烷制成每1 mL含10 mg的溶液，摇匀。精密量取1 mL，用异辛烷稀释至100 mL，摇匀。精密量取1 mL于100 mL容量瓶中，用异辛烷稀释至100 mL，摇匀，即得（每1 mL含CS21.085 μg）。

1.2.2 供试品溶液的制备 取样品粉碎，过三号筛。精密称取1 g，精密加入异辛烷5 mL，加HCl-SnCl2溶液5 mL，摇匀，立即密封。置80℃水浴中加热1 h，将溶液每15 min振摇一次。冷却，5000 r/min离心3 min，取上层有机相作为供试品溶液。

1.3 数据处理

本试验采用二次方程法获得对照品的校准曲线，再以此校准曲线计算供试品中CS2的残留量。

2 结果与分析

2.1 色谱条件

DB-624弹性石英毛细管柱（30m×0.32mm×1.8μm），载气为高纯氮气，柱流速1.5 mL/min；进样口温度为80℃，分流进样，分流比5:1，进样量2 μL。柱温程序：初始温度40℃，保持6 min，以50℃/min升至220℃，保持2 min。火焰光度检测器（FPD），硫元素滤光片，检测器温度220℃。理论板数以CS2计应不低于15000。对照品和代表性样品色谱图如图1所示。

图1 代表性色谱图CS2色谱峰

2.2 线性关系考察

取CS2对照品，加异辛烷制成每10 mg/mL的溶液，作为对照品贮备溶液。临用时用异辛烷分别稀释制成每 1 mL 分别含CS20.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg的溶液，采用GC-FPD进行检测。由于火焰光度检测器检测S元素时，峰面积与进样量为二次方程关系，因此以二次方程法计算校准曲线，加权方法1/C。经计算，线性方程为y=11542248x2-245817x+156475，相关系数r2=1.0000，标准曲线如图2所示。

图2 CS2对照品标准曲线

2.3 精密度试验

取0.2 μg/mL的CS2对照溶液，连续进样6次，结果表明峰面积的RSD为2.0%，表明仪器精密度良好。

2.4 灵敏度试验

取CS2对照品溶液用异辛烷逐级稀释测定，以信噪比不低于3:1和10:1确定检测限和定量限，作为仪器检出限。经检测本方法的检测限为0.02 mg/kg，定量限为0.05 mg/kg。

2.5 回收率试验

本研究以福美双和代森锰锌2种代表性二硫代氨基甲酸酯类农药为研究对象，对空白样品进行加样回收实验。分别添加已知含量的代森锰锌溶液（CS2含量为46.85%）和福美双溶液（CS2含量为53.78%）的对照品，分别设定低、中、高3个对照品添加水平。取加味逍遥片空白制剂1 g，在低水平分别加入1.5096 μg/mL代森锰锌溶液和1.9852 μg/mL福美双溶液各0.5 mL，中水平分别加入15.096 μg/mL代森锰锌溶液和19.852 μg/mL福美双溶液各0.5 mL，在高水平分别加入15.096 μg/mL代森锰锌溶液和19.852 μg/mL福美双溶液各1.0 mL，每一水平平行测定3份，以CS2测得量计算回收率以及RSD。结果表明代森锰锌和福美双的平均回收率分别为：111.1%和104.1%，RSD分别为2.9%和4.1%。总的来说，2个农药品种的回收率检测结果在70%～120%，且RSD≤15%，符合痕量多残留分析技术要求。

2.6 样品测定

采用已经建立的方法对36批次样品（包括3批制剂、27批药材和6批提取物）进行检测。结果表明：3批加味逍遥片中均无二硫代氨基甲酸类农药检出；27批药材中有1批甘草中检出CS2残留，浓度为0.05 mg/kg；6批提取物均检出该类农药，但检出量皆小于0.09 mg/kg。

2.7 水解条件的优化

参照文献的条件[12]，水解温度设定为80℃。同时对加热时间进行优化，操作步骤如下：精密量取代森锰锌对照溶液（15.096 μg/mL）及福美双对照溶液（19.852 μg/mL）各0.2 mL，分别置于20 mL顶空瓶中，加异辛烷5 mL，HCl-SnCl2溶液5 mL，密封，分别在80℃水浴中加热0、20、40、60、90、120 min后取出，待其冷却，取上层有机相进样测定。实验结果表明：水浴加热60 min或以上可水解完全，水解时间考察情况见图3。最终本研究采用60 min作为水解时间。

图3 水解时间考察

3 讨论与结论

3.1 讨论

传统的二硫代氨基甲酸酯类农药检测时通常采用顶空进样，但顶空进样精密度差，且由于顶空气体中存在高浓度HCl气体，对气相色谱的进样部件造成严重腐蚀，可操作性欠佳。故本研究根据相似相容原理，将顶空进样改为溶液进样，且优化了萃取溶剂，非极性的异辛烷对CS2有很好的溶解提取效果，故使用异辛烷作为萃取溶剂，提高了实验方法的灵敏度，简化了实验操作。

现行版《中国药典》中尚未涉及中药材及制剂中二硫代氨基甲酸酯类农药的残留限度检查，故本研究参照了《GB 2763—2019食品中农药最大残留限量》和欧洲药典对检测结果是否合格进行判断。在食品标准中，代森锰锌在不同产品中的最大残留限量值[20]为0.1～5.0 mg/kg，福美双的最大残留限量亦为0.1～5.0 mg/kg。欧洲药典规定植物药中二硫代氨基甲酸酯类农药的最大残留限量以CS2计应不高于2.0 mg/kg。本研究结果表明无论是加味逍遥片或其处方中药材的二硫代氨基甲酸酯类农药残留量皆远低于欧洲药典限量标准，且低于中国食品最大残留限量中较为严格的限量值，样品测定结果皆符合标准规定。在药材检测中，有1批甘草药材检出CS2残留，浓度为0.05 mg/kg。有研究表明[21-22]福美双和代森锰锌对于甘草种子的表面消毒效果最好，故在甘草实际种植中此2种农药可能被作为甘草种子的消毒剂使用。

3.2 结论

本研究测定结果显示加味逍遥片及相对应药材中均无农药检出，但2种中间提取物皆检出二硫代氨基甲酸酯类农药。参考制剂及提取物制备过程，对其原因及农药转移过程进行推测。加味逍遥片制法为提取物A和提取物B，加微晶纤维素流化床制粒，加薄荷脑和硬脂酸镁压片，最后欧巴代包衣。提取物A、B为组方中2组药材分别水提取、静置、上清液浓缩收膏。提取物出膏率为提取物重量与药材总投料量的比值，经计算提取物A的出膏率约为50%，即药材浓缩了约一倍，提取物B的出膏率为15%，即浓缩了约6.7倍。本研究中GC法的定量限为0.05 mg/kg，药材中有可能含有微量二硫代氨基甲酸酯类农药，但因含量低于定量限未被检出，提取物的制法使该类农药在提取物中富集而被检出。而由中间提取物生产为制剂的过程，提取物浓度被稀释，由于本研究检测的提取物中CS2残留量均较低，故在制剂中无该类农药残留检出。

本研究建立了加味逍遥片中福美双和代森锰锌残留量的GC检测方法。通过方法学验证，本方法准确性和重现性良好，灵敏度较高，可用于加味逍遥片中福美双和代森类农药的检测，为日常生产监控及风险监测提供参考。同时该方法对常用二硫代氨基甲酸酯类农药的检测方法进行优化，较大的提高了方法的可操作性，节省了实验时间，亦为其他中药材中此类农药的检测提供技术借鉴。