通过生物信息学方法评估Treg细胞在泌尿系肿瘤中的浸润模式

方启翔，罗 楠，陈 炜，张 盼，吴大鹏，曾 津

(1.西安交通大学第一附属医院泌尿外科，陕西西安 710061；2．昆明医科大学第二附属医院眼科，云南昆明 654100)

调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是一类具有免疫应答无能和免疫抑制两大特征的CD4+T细胞，可通过抑制效应性T细胞、肥大细胞、树突状细胞及B细胞的免疫反应下调机体对外来或自身抗原的应答水平以维持机体免疫耐受[1]。Treg对效应细胞的抑制作用具有两面性，一方面对于维持宿主自我耐受很重要；另一方面在肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)中Treg对效应细胞的抑制被证明可抑制抗肿瘤免疫[2]。因此，在肿瘤的免疫治疗中辅以针对Treg的治疗方法或可达到增强疗效的目的。现有研究证实，在乳腺癌、结直肠癌、肺癌和卵巢癌等肿瘤中Treg数量升高往往标志着预后不良[3]。有趣的是，也有研究发现Treg在肿瘤组织富集时可影响相关肿瘤进程，进而改善肿瘤患者预后[4]。目前认为这一矛盾可能由于肿瘤类型的差异、瘤内Treg细胞在表型和功能上存在异质性、Treg的分布模式(癌巢或基质)以及Treg与肿瘤中某些免疫亚群浸润的模式[5]。

近年来随着研究的深入,免疫治疗在泌尿系肿瘤治疗中的地位越来越高，Treg细胞与泌尿系肿瘤发生发展的关系也受到关注。现有研究多表明Treg细胞在肾癌、前列腺癌中的浸润预示着不良预后，而在膀胱癌则尚存争议。本文基于TCGA数据库对Treg细胞在泌尿系肿瘤中的分布及预后进行评估，探讨其在肿瘤预后、免疫治疗中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料获取我们从癌症和肿瘤基因图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库下载了肾透明细胞癌(kidney renal clear cell carcinoma，KIRC)肿瘤样本539例和正常样品72例、膀胱癌(bladder urothelial carcinoma，BLCA)肿瘤样本411例和正常样品19例、前列腺癌(prostate adenocarcinoma，PRAD)肿瘤样本489例和正常样品51例患者的转录组数据和临床信息(表1)，本文下载的所有数据截止2020年11月15日。

1.2 免疫细胞矩阵的获取在R语言中利用limma包进行标准化，提取肿瘤组织及正常组织mRNA表达谱数据，应用Perl语言整合CIBERSORT开源代码(参见文献[6]，运用反卷积算法开发，可基于标准化的基因表达数据来估算组织的细胞组成，量化细胞类型的丰度)来预测肿瘤及癌旁组织中免疫细胞的丰度，并对预测结果进行整理筛除，获得样本与免疫细胞的矩阵数据。并利用vioplot包对整理后的矩阵数据进行分析(P<0.05为差异具有统计学意义)，绘制3种肿瘤与癌旁组织内22种免疫细胞的小提琴图。

1.3 Treg细胞与其他免疫细胞的相关性为了探讨Treg细胞与其他免疫细胞的相关性，我们利用corrplot包对得到的肿瘤样本免疫细胞矩阵进行相关性分析。

1.4 Treg细胞对肿瘤预后的影响利用Survival包完成Treg细胞丰度与患者预后的相关性计算并绘制生存曲线，而后对T分期与Treg细胞浸润进行相关性分析。

1.5 Treg细胞与肿瘤中关键通路的相关性研究表明炎性环境与Treg细胞有关，而干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)的水平可模拟炎性微环境[7]，因此我们进一步研究3种肿瘤中Treg浸润程度是否与IFN-γ有关。我们通过ssGSEA自定义Hallmark(C2)基因集富集分析计算IFN-γ相关通路得分，并计算Treg与IFN-γ通路的相关性。另外，Treg细胞通过整合素αvβ8激活转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)，这一机制是Treg细胞抑制体内CD4+T细胞增殖的重要机制[8]。我们通过ssGSEA使用GO(BP)进行基因集富集分析获得样本整合素信号通路得分情况。

2 结 果

2.1 基线资料从TCGA数据库网站下载肾透明细胞癌、膀胱癌、前列腺癌转录组及临床资料(主要有性别、年龄、生存时间、生存状态及TNM分期)，参见表1。

表1 TCGA中肾透明细胞癌、膀胱癌、前列腺癌患者的基线资料 [例(%)]

2.2 22种免疫细胞在肿瘤及癌旁组织中的分布与正常组织相比，肾透明细胞癌组织中的Treg细胞浸润水平较高，差异有统计学意义(P=0.002，图1A)。膀胱癌组织中的Treg细胞浸润水平与正常组织相比无显著差异(P=0.28，图1B)，前列腺癌组织中Treg细胞的浸润水平高于正常组织(P=0.011，图1C)。

图1 肾透明细胞癌(A)、膀胱癌(B)、前列腺癌(C)中Treg的浸润水平

2.3 免疫细胞浸润的相关性我们利用corrplot包对得到的肿瘤样本免疫细胞矩阵进行相关性分析(P<0.05，图2)。结果显示：肾透明细胞癌组织中Treg与CD8+T细胞(r=0.25)、滤泡辅助性T细胞(r=0.25)呈弱的正相关，而与M2巨噬细胞(r=-0.30)、未活化肥大细胞(r=-0.23)、未活化CD4+记忆性T细胞(r=-0.28)呈弱的负相关。膀胱癌组织中Treg与幼稚B细胞(r=0.2)呈弱的正相关，而与活化CD4+记忆性T细胞(r=-0.27)呈弱的负相关。前列腺癌组织中Treg与CD8+T细胞(r=0.46)、记忆性B细胞(r=0.29)呈正相关，而与未活化肥大细胞(r=-0.29)、浆细胞(r=-0.24)呈弱的负相关。

图2 肾透明细胞癌(A)、膀胱癌(B)、前列腺癌(C)中22种免疫细胞的相关性分析

2.4 Treg细胞对预后的影响及其与肿瘤T分期的相关性Treg在肾透明细胞癌中高密度浸润与低生存率存在显著相关性(P=0.01，图3A)，Treg的浸润与肿瘤组织大小相关(P=0.002，图3D)，差异有统计学意义。而在膀胱癌中却得到了相反的结果，Treg在膀胱癌中高密度浸润与高生存率存在显著相关性(P=0.045，图3B)，但其浸润密度与T分期无明显相关性(P=0.905，图3E)。Treg的浸润程度似乎与前列腺癌患者的生存率和T分期无明显相关性(图3C、F)。

2.5 Treg细胞与肿瘤中的IFN-γ相关通路的相关性以及整合素信号通路得分我们研究了样本中Treg的丰度分布、Treg细胞与IFN-γ相关通路的相关性以及各样本中整合素信号通路激活的情况(图4)。结果发现肾透明细胞癌、膀胱癌中Treg的丰度分布大致相同，前列腺癌样品中Tregs丰度偏低。Treg与IFN-γ相关通路在肾透明细胞癌存在较弱正相关，膀胱癌、前列腺癌中存在着较弱负相关(|r|<0.2，P<0.05)，这一结果提示造成Treg在3种肿瘤中表现不一致可能与炎性微环境的差异有关。整合素信号通路得分情况在3种肿瘤中大致相似。

A：肾透明细胞癌；B：膀胱癌;C：前列腺癌。各图左上：丰度；左下：与IFN-γ相关通路的相关性；右下：整合素信号通路表达。图4 Treg细胞在肿瘤样本中的丰度、Treg细胞与IFN-γ相关通路的相关性及肿瘤样本中整合素信号通路表达

3 讨 论

程序性死亡受体1(programmed death ligand-1，PD-1)是T细胞上的一种蛋白，可与肿瘤或正常细胞上的程序性死亡配体1(programmed cell death 1 ligand 1,PDL1)结合，导致T细胞功能下调，肿瘤可通过这一机制逃避免疫系统的清除[9-10]。免疫检查点阻断剂(immune checkpoint blockade,ICB)可通过阻止肿瘤细胞与T细胞间的相互作用，从而增强抗肿瘤免疫。但也带来了新的问题，有文献报道ICB对PD-1的阻断可诱导Treg细胞增殖，从而导致抗肿瘤免疫的抑制，不仅降低了抗PD-1的作用，甚至引起肿瘤的超进展(hyperprogressive disease,HPD)[11]。因此，对于特定肿瘤消耗肿瘤微环境中的Treg细胞对于改善免疫治疗的疗效至关重要。

有研究表明Treg在肾癌中的浸润不仅预示着不良结局，还与术后局部复发转移相关[12]，前列腺癌患者接受的雄激素剥夺疗法(androgen deprivation therapy，ADT)会造成Treg增加，降低ADT治疗效果[13]。MALIN等[14]发现在体外Foxp3+Treg能够抑制M2巨噬细胞以及基质金属蛋白酶MMP2的产生，与膀胱癌良好预后相关。我们的研究发现Treg在肾透明细胞癌组织中高浸润预示着不良预后，而在膀胱癌中高浸润则代表了预后良好，这一结果与上述报道一致。既往研究表明Treg受到炎性环境调控，为了明确Treg在肾透明细胞癌和膀胱癌中出现相反的预后结局是否与炎性环境相关，我们进一步研究了肿瘤组织中IFN-γ与Treg的关系，结果显示肾癌中IFN-γ与Treg正相关，而在膀胱癌中则是负相关。有研究表明炎性环境下DBC1基因可通过Caspase 8-p38信号通路介导Foxp3蛋白的减少及Treg功能的降低[15]，故我们认为Treg在肾透明细胞癌和膀胱癌中的不同预后表现可能是由于所处的炎性环境不同，这也可能是造成膀胱癌中Treg细胞浸润水平与正常组织相比无显著差异的原因。

现今，Treg在肿瘤中的作用仍然存在着争议，这可能与炎性环境、Treg亚型、肿瘤分期有关，需要更多研究来揭示。我们基于TCGA评估了Treg在泌尿系肿瘤中的表现并对一些重要的通路进行了分析。我们的研究尚存在一些局限性，现有研究多使用肿瘤患者的外周血细胞及肿瘤组织得到Treg细胞的浸润程度，我们采用算法估算可能存在一定误差；我们从TCGA中获得的样本缺乏治疗数据，不能排除不同治疗方式引起的混杂。目前Treg在肿瘤中的作用机制正在日益清晰，并在联合放疗、化疗、免疫治疗中发挥重要作用[16]。深入挖掘其机制并将其作为肿瘤治疗的一种手段是十分有意义的。

总之，利用生物信息学对Treg在肾透明细胞癌、膀胱癌、前列腺癌中的浸润情况和对其预后的影响进行初步评估，提示Treg在肿瘤中的作用可能受到特定类型癌症的影响，针对Treg的治疗是一种有潜力的抗肿瘤方式。