复方鲜竹沥液微生物限度检查法的建立

张静，张春华，周萍，章瑛，谢茵

江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029

复方鲜竹沥液为江西省特色中药制剂，检验标准收载于《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）2020 年版一部［1］，标准对其微生物限度要求较为严格，需氧菌总数≤102cfu，霉菌和酵母菌总数≤10 cfu，并不得检出大肠埃希菌。复方鲜竹沥液处方包括鲜竹沥、生半夏、鱼腥草、枇杷叶、桔梗、生姜、薄荷素油等七味药材，用于痰热咳嗽，痰黄黏稠等。该制剂为合剂，含有丰富的维生素和水分，pH 在4.8～6.0 之间，处方中又加入蔗糖或甜菊素等微生物生长所需的物质，环境极易于微生物的生长和繁殖。制剂的微生物污染程度，对制剂的有效性、稳定性和安全性都产生重大的影响，也直接关系到临床用药的安全［2-4］。鉴于复方鲜竹沥液的使用较广，生产企业较多，有必要对其微生物污染状况进行研究，建立适用于不同企业的微生物限度检查方法，为复方鲜竹沥液的用药安全和质量控制提供参考。本研究选择了江西省内6 家生产企业共计9 批次复方鲜竹沥进行方法学考察及验证。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

YXQ-LS-50S Ⅱ高压蒸汽灭菌器（上海博迅实业医疗器械有限公司），Sartorius T601-L 电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），SW-CJ-2D 净化工作台（苏州净化有限公司），PYX-DHS 细菌培养箱、MJ-160B 霉菌培养箱、PYX-DHS 隔水式恒温培养箱（均为上海跃进医疗器械厂）。

1.2 培养基与菌种

胰酪大豆胨液体培养基（北京三药科技开发有限公司，批号：20200324），胰酪大豆胨琼脂培养基（北京陆桥技术股份有限公司，批号：191104），沙氏葡萄糖液体培养基（北京陆桥技术股份有限公司，批号：20200310），沙氏葡萄糖琼脂培养基（北京陆桥技术股份有限公司，批号：20200310），麦康凯液体培养基（青岛海博生物技术有限公司，批号：20190927），麦康凯琼脂培养基（青岛海博生物技术有限公司，批号：20191121），4-甲基伞形酮葡糖苷酸-蛋白胨培养基（青岛海博生物技术有限公司，批号：20191124）。上述培养基进行适用性检查，生长能力、抑制能力及指示特性均符合实验要求。

菌种均来自中国食品药品检定研究院。使用菌种信息如下：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63501］，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26003］，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10104］，白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］，黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98003］，大肠埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］。以下使用菌种均按《中国药典》2020 年版要求稀释制备，做活菌计数备用。

1.3 样品

抽取江西省内6 家生产厂家，包括江西南昌济生制药有限责任公司3 批（规格：10 mL、20 mL，150 mL），江西远东药业股份有限公司1 批（规格：10 mL），江西济民可信药业有限公司2 批（规格：10 mL、20 mL），江西汇仁药业股份有限公司1 批（规格：10 mL），江西天施康中药股份有限公司1 批（规格：10 mL），江西九华药业有限公司1 批（规格：10 mL），共计9 批次复方鲜竹沥液。

2 实验方法与结果

建立样品的微生物限度检查法时，首先需进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该样品的微生物限度检查，也就是确认样品在一定的检验量和一定的检验条件下无抗菌活性或抗菌活性在该条件下被消除到可以忽略不计，尽可能地去除或者中和抗菌活性，以保证本检验结果的准确可靠和检验方法的完整度。实验参照《中国药典》2020 年版四部通则1105（微生物计数法）、1106（控制菌检查法）［7］进行试验，以确定复方鲜竹沥液的微生物限度检查方案的完整建立［5-7］。

2.1 实验方法

样品包含混匀的样品原液和1∶10 供试液。取样品10 mL，置锥形瓶中，加90 mL pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液混匀，作为1∶10 供试液。

按如下公式计算加菌回收比值：

2.1.1 需氧菌总数计数法 试验组：取混匀的样品原液9.9 mL 和1∶10 供试液9.9 mL，分别加入适宜浓度的试验菌液0.1 mL，混匀，使每1 mL 供试液中含菌量≤100 cfu。取1 mL 注入平皿，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，置30～35 ℃培养箱培养24 h～ 72 h，每隔24 h 观察一次结果。供试品对照组：取上述制备好的原液和1∶10 供试液，以pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液，同试验组操作，测定供试品本底菌数。菌液对照组：取相应pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代供试液，按试验组操作加入试验菌液0.1 mL，混匀，后续操作同试验组。

2.1.2 霉菌和酵母菌总数计数法 试验组：取混匀的样品原液9.9 mL，加入适宜浓度的试验菌液0.1 mL，混匀，使每1 mL供试液中含菌量≤100 cfu。取1 mL注入平皿，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，置20～25 ℃培养箱培养24 h～120 h,每隔24 h 观察一次结果。供试品对照组和菌液对照组参照“2.1.1”项下制备，培养基为沙氏葡萄糖琼脂培养基，置20～25 ℃培养箱培养24 h～120 h，每隔24 h 观察一次结果。

2.1.3 大肠埃希菌检查法 试验组：取1∶10 供试液10 mL 加入100 mL 胰酪大豆胨液体培养基中，同时加入＜100 cfu的大肠埃希菌液，置35 ℃培养18 h～24 h，取上述培养物1 mL 接种至100 mL 麦康凯液体培养基中，42 ℃培养24～48 h 后取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上，35 ℃培养18～72 h，取麦康凯琼脂平板上菌落经纯化后的培养物，接种至含5 mL 4-甲基伞形酮葡糖苷酸-蛋白胨培养基的试管内培养，分别于5 h、24 h 在366 nm 波段处紫外线下观察，同时用未接种的4-甲基伞形酮葡糖苷酸-蛋白胨培养基作空白对照。观察后，沿管壁加入数滴靛基质试液再观察。阴性对照组：取pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10 mL 照大肠埃希菌检查法操作。

2.2 结果

根据《中国药典》2020 年版四部通则1105（微生物计数法），需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法学验证需三次独立平行的实验数据，结果判定为回收比值均在0.5～2 之间；控制菌检查方法为能有所加菌落的典型特征反应来判定。

9 批次复方鲜竹沥液经过验证：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数在三次独立的平行试验中各种菌落的回收比值均在0.8～1.3 之间，符合《中国药典》2020 年版四部通则1105（微生物计数法）判定要求，见表1。大肠埃希菌检查亦能见所加菌落的典型反应，见表2。

表1 平行试验中菌落的回收比值

表2 大肠埃希菌检查法方法学验证试验结果

6 家企业的9 批次样品，经过试验最后确定微生物限度检查法略有不同。

其中8 批次样品方法为：取样品原液按平皿法（1 mL/皿），依法测定需氧菌总数；取样品原液按平皿法（1 mL/皿），依法测定霉菌和酵母菌总数；取1∶10 供试液10 mL 至100 mL 胰酪大豆胨液体培养基，依法检查大肠埃希菌。1 批次样品方法为：取1∶10 供试液按平皿法（1 mL/皿），依法测定需氧菌总数；取样品原液按平皿法（1 mL/皿），依法测定霉菌和酵母菌总数；取1∶10 供试液10 mL 至100 mL 胰酪大豆胨液体培养基，依法检查大肠埃希菌。同一企业不同规格的样品方法一致。结果见表3。

表3 微生物限度检查方法

3 讨论

复方鲜竹沥液为中药液体口服制剂，其本身并无抑菌性，容易受微生物污染而导致药物变质，处方中通常加有一定量抑菌剂以保持制剂在保质期内不受微生物入侵。《中国药典》2020 年版一部收载的复方鲜竹沥液制法中明确指出1 000 mL的复方鲜竹沥液中加入3 g 苯甲酸钠，抑菌剂浓度为0.3%。经查阅企业的处方资料，6 家企业的复方鲜竹沥液均加入一定量的抑菌剂苯甲酸钠。复方鲜竹沥液微生物限度检查方法的略有不同有可能为企业制备时添加抑菌剂苯甲酸钠的浓度不一致导致。

实验结果表明不同生产企业的样品，微生物限度检查法略有差异，体现在需氧菌总数检查方面，两种方法分别样品原液和1∶10 供试液。方法的差异与复方鲜竹沥液处方中加入的抑菌剂浓度有关，与样品的规格无关。