十三味疏肝胶囊中马兜铃酸A的检测方法研究

黄晓燕，李荣玮，曾蒲军，梁晟，李瑞莲

湖南省药品检验研究院，湖南 长沙 410001

十三味疏肝胶囊由牛黄、人工牛黄、西红花、绿绒蒿、马兜铃等13 味药材加工制成，具有清热利湿、疏肝理脾、化瘀散结的功效,临床上主要用于肝胆湿热、气滞血瘀所致的肋痛、脘胀，急慢性乙型肝炎见上述症候者。现行质量标准为国家食品药品监督管理局国家药品标准WS-11528（ZD-1528）-2002-2012Z。

近年来关于马兜铃属植物引起肾毒性的临床报道日益增多［1-4］，由于马兜铃酸具有肾毒性和致癌作用，国际癌症研究机构将其确定为I 类致癌物。本品处方中的马兜铃为马兜铃科植物，含有马兜铃酸A等成分。目前尚未见十三味疏肝胶囊中马兜铃酸检测的文献报道,为了保证用药安全性,本研究参考有关文献［5-12］，采用超高效液相色谱（UHPLC）建立了本品中马兜铃酸A的含量测定方法,并采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）对测定结果进行了进一步的验证，以为其质量控制和临床用药安全提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

电子分析天平（METTLER XSE205）；超声仪（昆山市超声仪器有限公司，KQ500DE）；超高效液相色谱仪（Thermo Fisher Ultimate 3000 RS）；液质联用仪（DIONEX Ultimate 3000-TSQ ENDURA）。

1.2 试药

马兜铃酸A（批号：110746-201611，纯度98.9%），购自中国食品药品检定研究院。甲酸、乙腈均为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为蒸馏水。十三味疏肝胶囊样品为市售产品（批号：20170401、20180102-1、20180102-2）；阴性样品按处方自制。

2 方法与结果

2.1 UHPLC-PDA 法

2.1.1 色谱条件 色谱柱为 Thermo Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），进样量为1 μL，柱温为30 ℃，流动相为乙腈-0.5%冰醋酸（30∶70），流速为0.3 mL/min。

2.1.2 供试品溶液的制备 取本品内容物适量，研细，混匀，取约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10%甲酸-甲醇（20∶80）的混合溶液25 mL，称定重量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放凉，再称定重量，用10%甲酸-甲醇（20∶80）的混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 对照品溶液的制备 精密称取马兜铃酸A 对照品16.85 mg，置50 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液（333.293 μg/mL），分别精密量取对照品贮备液适量，加甲醇稀释成系列浓度对照品溶液（49.994、19.998、9.998、4.999、1.999 μg/mL）。

2.1.4 阴性样品溶液制备 取按样品同样工艺制备而成的缺马兜铃的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

2.1.5 专属性试验 精密吸取马兜铃酸A 对照品溶液（19.998 μg/mL）、阴性对照溶液与供试品溶液各1 µL，依法进行测定。结果供试品色谱中，在与马兜铃酸A对照品色谱保留时间相同的位置上，有相应色谱峰，而缺马兜铃阴性对照溶液无相应色谱峰，表明处方中其它药味对测定结果无干扰，专属性强，结果见图1。

图1 十三味疏肝胶囊高效液相色谱图

2.1.6 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液（批号：20180102-1），连续进样6 次，每次5 µL，结果马兜铃酸A 峰面积值RSD 为1.7%，精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液（批号：20180102-1），分别于配制后的0、6、12、16、24 h，精密吸取5 µL，注入液相色谱仪，测定。结果马兜铃酸A 峰面积值RSD 为2.1%，表明供试品溶液在配制后24 h 内基本稳定。

2.1.8 重复性试验 取同一批号（批号：20180102-1）样品6 份，依法制备供试品溶液，测定。结果马兜铃酸A的含量为0.12 mg/g（RSD 为1.2%），本方法重复性较好。

2.1.9 加样回收率试验 取已知马兜铃酸A 含量（0.12 mg/g）的同一批样品（批号：20180102-1）约0.75 g，共六份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入马兜铃酸A 对照品溶液（0.049 994 mg/mL）2 mL，水浴低温蒸干，参照“2.1.2”项下的制备方法制备供试品溶液，测定并计算，结果见表1。结果马兜铃酸A 平均回收率为93.38%，RSD为1.35%，结果表明本方法加样回收率较好。

表1 马兜铃酸A回收率试验结果（n=6）

2.1.10 线性关系 吸取马兜铃酸A 系列对照品溶液（49.994、19.998、9.998、4.999、1.999 μg/mL），依法测定。以马兜铃酸A的量为横坐标，峰面积值为纵坐标绘制标准曲线，结果马兜铃酸A的回归方程为Y=0.161 89X+0.002 73，r=0.999 9，结果表明马兜铃酸A 在1.999～49.994 ng/mL 范围内线性关系良好。

2.1.11 测定结果 取十三味疏肝胶囊样品，照“2.1.2”项下方法制成供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，3 批样品均检出马兜铃酸A（批号：20170401，0.11 mg/g；批号：20180102-1，0.12 mg/g；批号：20180102-2，0.12 mg/g）。

2.2 LC-MS 法

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Welch UHPLC XB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 µm），流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0～7 min、30%→60% A，7～12 min、60%→100% A），柱温：35 ℃，进样量：5 µL，流速：0.3 mL/min。

2.2.2 质谱条件 m/z 范围：100～1 000；离子化模式为ESI+，离子传输管温度350 ℃，毛细管电压3.2 kV，干燥气温度350 ℃，碰撞能量10 V，鞘气流速30 Arb，辅助气流量10 Arb，扫描模式为MRM。

2.2.3 对照品溶液的制备 取“2.1.3”项下的马兜铃酸A 对照品溶液（1.999 μg/mL），即得。

2.2.4 供试品溶液的制备 取“2.1.2”项下的供试品溶液适量，用甲醇稀释10 倍，作为供试品溶液。

2.2.5 测定法 精密吸取上述对照品溶液及供试品溶液各5 µL，注入液相色谱仪测定，记录色谱图，结果见图2。

图2 十三味疏肝胶囊选择离子色谱图

2.3 测定结果

在 UHPLC-PDA 法中3 批样品检出含马兜铃酸A，采用LC-MS 法验证，均检出与对照品相同的分子离子峰及其碎片峰。

3 讨论

3.1 样品制备方法的选择

采用了超声处理、加热回流2 种提取方法，结果二者提取得率基本相当，因超声提取操作简便故选之。分别用甲醇、70%甲醇、10%甲酸-甲醇（20∶80）混合溶液各25 mL 超声提取，结果表明，10%甲酸-甲醇（20∶80）混合溶液提取的待测成分得率稍高，故选择10%甲酸-甲醇（20∶80）混合溶液为提取溶剂。

3.2 流动相的选择

UHPLC-PDA 法测定时，考察了乙腈-0.5%冰醋酸（30∶70）、甲醇-0.5% 冰醋酸（48∶52）、乙腈-0.1%三氟乙酸（33∶67）、乙腈-0.1%磷酸（33∶67）、乙腈-0.1%甲酸（33∶67）五种流动相的分离效果，结果以乙腈-0.5%冰醋酸（30∶70）分离效果最好，故选之。

LC-MS/MS 法测定时，考察了10 mmol/L 醋酸铵溶液（氨水调pH 至7.5）-乙腈（75∶25）、0.1%甲酸溶液-乙腈（梯度洗脱）、含0.1%甲酸的10 mmol/L 乙酸铵溶液-乙腈（梯度洗脱）三种流动相条件，结果发现，以含0.1%甲酸的10 mmol/L 乙酸铵溶液-乙腈为流动相，分子离子峰及加和离子峰响应较好，故选之。

3.3 测定结果及分析

对3 批十三味疏肝胶囊样品进行检验，结果均检出马兜铃酸A，提示本品可能存在一定的用药安全风险。

本文建立的UHPLC-PDA 法可准确检出十三味疏肝胶囊中含有的马兜铃酸A，与LC-MS 法的验证结果一致。由此可见所建立的UHPLC-PDA 法专属性强、准确、可靠，能有效地控制投料马兜铃药材质量，保障人民的用药安全。