十三味疏肝胶囊中马兜铃酸A的检测方法研究

2021-02-14 10:58黄晓燕李荣玮曾蒲军梁晟李瑞莲
药品评价 2021年23期
关键词:甲酸疏肝乙腈

黄晓燕,李荣玮,曾蒲军,梁晟,李瑞莲

湖南省药品检验研究院,湖南 长沙 410001

十三味疏肝胶囊由牛黄、人工牛黄、西红花、绿绒蒿、马兜铃等13 味药材加工制成,具有清热利湿、疏肝理脾、化瘀散结的功效,临床上主要用于肝胆湿热、气滞血瘀所致的肋痛、脘胀,急慢性乙型肝炎见上述症候者。现行质量标准为国家食品药品监督管理局国家药品标准WS-11528(ZD-1528)-2002-2012Z。

近年来关于马兜铃属植物引起肾毒性的临床报道日益增多[1-4],由于马兜铃酸具有肾毒性和致癌作用,国际癌症研究机构将其确定为I 类致癌物。本品处方中的马兜铃为马兜铃科植物,含有马兜铃酸A等成分。目前尚未见十三味疏肝胶囊中马兜铃酸检测的文献报道,为了保证用药安全性,本研究参考有关文献[5-12],采用超高效液相色谱(UHPLC)建立了本品中马兜铃酸A的含量测定方法,并采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)对测定结果进行了进一步的验证,以为其质量控制和临床用药安全提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

电子分析天平(METTLER XSE205);超声仪(昆山市超声仪器有限公司,KQ500DE);超高效液相色谱仪(Thermo Fisher Ultimate 3000 RS);液质联用仪(DIONEX Ultimate 3000-TSQ ENDURA)。

1.2 试药

马兜铃酸A(批号:110746-201611,纯度98.9%),购自中国食品药品检定研究院。甲酸、乙腈均为色谱纯,其他试剂均为分析纯,水为蒸馏水。十三味疏肝胶囊样品为市售产品(批号:20170401、20180102-1、20180102-2);阴性样品按处方自制。

2 方法与结果

2.1 UHPLC-PDA 法

2.1.1 色谱条件 色谱柱为 Thermo Hypersil GOLD(100 mm×2.1 mm,1.9 μm),进样量为1 μL,柱温为30 ℃,流动相为乙腈-0.5%冰醋酸(30∶70),流速为0.3 mL/min。

2.1.2 供试品溶液的制备 取本品内容物适量,研细,混匀,取约1.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入10%甲酸-甲醇(20∶80)的混合溶液25 mL,称定重量,超声处理(功率500 W,频率40 kHz)30 min,放凉,再称定重量,用10%甲酸-甲醇(20∶80)的混合溶液补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.1.3 对照品溶液的制备 精密称取马兜铃酸A 对照品16.85 mg,置50 mL 量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得对照品贮备液(333.293 μg/mL),分别精密量取对照品贮备液适量,加甲醇稀释成系列浓度对照品溶液(49.994、19.998、9.998、4.999、1.999 μg/mL)。

2.1.4 阴性样品溶液制备 取按样品同样工艺制备而成的缺马兜铃的阴性样品,按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

2.1.5 专属性试验 精密吸取马兜铃酸A 对照品溶液(19.998 μg/mL)、阴性对照溶液与供试品溶液各1 µL,依法进行测定。结果供试品色谱中,在与马兜铃酸A对照品色谱保留时间相同的位置上,有相应色谱峰,而缺马兜铃阴性对照溶液无相应色谱峰,表明处方中其它药味对测定结果无干扰,专属性强,结果见图1。

图1 十三味疏肝胶囊高效液相色谱图

2.1.6 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液(批号:20180102-1),连续进样6 次,每次5 µL,结果马兜铃酸A 峰面积值RSD 为1.7%,精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液(批号:20180102-1),分别于配制后的0、6、12、16、24 h,精密吸取5 µL,注入液相色谱仪,测定。结果马兜铃酸A 峰面积值RSD 为2.1%,表明供试品溶液在配制后24 h 内基本稳定。

2.1.8 重复性试验 取同一批号(批号:20180102-1)样品6 份,依法制备供试品溶液,测定。结果马兜铃酸A的含量为0.12 mg/g(RSD 为1.2%),本方法重复性较好。

2.1.9 加样回收率试验 取已知马兜铃酸A 含量(0.12 mg/g)的同一批样品(批号:20180102-1)约0.75 g,共六份,精密称定,置具塞锥形瓶中,分别精密加入马兜铃酸A 对照品溶液(0.049 994 mg/mL)2 mL,水浴低温蒸干,参照“2.1.2”项下的制备方法制备供试品溶液,测定并计算,结果见表1。结果马兜铃酸A 平均回收率为93.38%,RSD为1.35%,结果表明本方法加样回收率较好。

表1 马兜铃酸A回收率试验结果(n=6)

2.1.10 线性关系 吸取马兜铃酸A 系列对照品溶液(49.994、19.998、9.998、4.999、1.999 μg/mL),依法测定。以马兜铃酸A的量为横坐标,峰面积值为纵坐标绘制标准曲线,结果马兜铃酸A的回归方程为Y=0.161 89X+0.002 73,r=0.999 9,结果表明马兜铃酸A 在1.999~49.994 ng/mL 范围内线性关系良好。

2.1.11 测定结果 取十三味疏肝胶囊样品,照“2.1.2”项下方法制成供试品溶液,按上述色谱条件进行测定,3 批样品均检出马兜铃酸A(批号:20170401,0.11 mg/g;批号:20180102-1,0.12 mg/g;批号:20180102-2,0.12 mg/g)。

2.2 LC-MS 法

2.2.1 色谱条件 色谱柱:Welch UHPLC XB-C18(2.1 mm×50 mm,1.8 µm),流动相:乙腈(A)-0.1%甲酸(B),梯度洗脱(0~7 min、30%→60% A,7~12 min、60%→100% A),柱温:35 ℃,进样量:5 µL,流速:0.3 mL/min。

2.2.2 质谱条件 m/z 范围:100~1 000;离子化模式为ESI+,离子传输管温度350 ℃,毛细管电压3.2 kV,干燥气温度350 ℃,碰撞能量10 V,鞘气流速30 Arb,辅助气流量10 Arb,扫描模式为MRM。

2.2.3 对照品溶液的制备 取“2.1.3”项下的马兜铃酸A 对照品溶液(1.999 μg/mL),即得。

2.2.4 供试品溶液的制备 取“2.1.2”项下的供试品溶液适量,用甲醇稀释10 倍,作为供试品溶液。

2.2.5 测定法 精密吸取上述对照品溶液及供试品溶液各5 µL,注入液相色谱仪测定,记录色谱图,结果见图2。

图2 十三味疏肝胶囊选择离子色谱图

2.3 测定结果

在 UHPLC-PDA 法中3 批样品检出含马兜铃酸A,采用LC-MS 法验证,均检出与对照品相同的分子离子峰及其碎片峰。

3 讨论

3.1 样品制备方法的选择

采用了超声处理、加热回流2 种提取方法,结果二者提取得率基本相当,因超声提取操作简便故选之。分别用甲醇、70%甲醇、10%甲酸-甲醇(20∶80)混合溶液各25 mL 超声提取,结果表明,10%甲酸-甲醇(20∶80)混合溶液提取的待测成分得率稍高,故选择10%甲酸-甲醇(20∶80)混合溶液为提取溶剂。

3.2 流动相的选择

UHPLC-PDA 法测定时,考察了乙腈-0.5%冰醋酸(30∶70)、甲醇-0.5% 冰醋酸(48∶52)、乙腈-0.1%三氟乙酸(33∶67)、乙腈-0.1%磷酸(33∶67)、乙腈-0.1%甲酸(33∶67)五种流动相的分离效果,结果以乙腈-0.5%冰醋酸(30∶70)分离效果最好,故选之。

LC-MS/MS 法测定时,考察了10 mmol/L 醋酸铵溶液(氨水调pH 至7.5)-乙腈(75∶25)、0.1%甲酸溶液-乙腈(梯度洗脱)、含0.1%甲酸的10 mmol/L 乙酸铵溶液-乙腈(梯度洗脱)三种流动相条件,结果发现,以含0.1%甲酸的10 mmol/L 乙酸铵溶液-乙腈为流动相,分子离子峰及加和离子峰响应较好,故选之。

3.3 测定结果及分析

对3 批十三味疏肝胶囊样品进行检验,结果均检出马兜铃酸A,提示本品可能存在一定的用药安全风险。

本文建立的UHPLC-PDA 法可准确检出十三味疏肝胶囊中含有的马兜铃酸A,与LC-MS 法的验证结果一致。由此可见所建立的UHPLC-PDA 法专属性强、准确、可靠,能有效地控制投料马兜铃药材质量,保障人民的用药安全。

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