吖啶橙染色结合流式细胞仪的方法检测精子DNA碎片率及与临床特征参数的相关性分析

杨宜英，曾泓杰，王征

（广州医科大学附属第三医院检验科，广东 广州510150）

全球大概10%～15%夫妇受不孕不育影响，其中因男性因素不育占50%左右［1］。父本DNA 异常会影响辅助生殖的成功率和胚胎质量、影响胚胎发育从而导致胚胎停育［2］。此外精子DNA 损伤与先天畸形及儿童疾病甚至儿童癌症关系密切。有研究表明精子DNA 损伤比传统精液质量对疾病有更好的诊断及预后意义［3］。

传统的精液分析与技师经验有关，质量控制难，结果不稳定，变异系数大。而且不育男性与正常男性的参数范围有很大的重叠。由于精子是高度专业化的细胞，精液分析只能评估精子某些方面的损伤及生殖功能部分完整性，无法直接测量精子的染色体损伤。已开发各种检测来评估精子的完整性从而反映精子损伤的程度，主要包括精子染色质结构测定（SCSA）、精子染色质分散测定、单细胞凝胶电泳或彗星测定测定、吖啶橙测试等［4-5］。相比标准精子参数（浓度，活力和形态），精子DNA 完整性具有更好的诊断和预后能力［6］。

精浆弹性蛋白酶是机体内水解弹性蛋白的酶，主要来源于白细胞。当生殖道感染时，由于精液白细胞增加，精浆蛋白酶也随之升高。普遍将精液中弹性蛋白酶＞1 000 ng/mL 定义为确诊感染。有报道称精浆弹性蛋白酶浓度可以反映生殖道炎症情况，并与精子质量相关并提示不孕［7-8］。然而也有报道发现不育患者的血液及精液中弹性蛋白酶含量与精液常规参数无相关性［9］。因此其含量与精子质量的关系还不明确。本研究采用吖啶橙染色结合流式细胞仪的方法检测男性患者精子DNA 碎片率（DNA fragmentation index，DFI）、精子成熟度（HDS）；测定了精子活力、总数、浓度等精液分析参数及患者临床特征指标。主要研究目的包括衡量传统精液分析参数与精子碎片率指数的结果一致性及相关性，并进一步研究影响精子碎片率的临床因素。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2020 年12 月至2021 年3 月广州医科大学附属第三医院生殖科就诊的男性患者标本142例。年龄在25～51 岁，中位数为34 岁，所有精液标本马上进行精液分析检测或精液完整性检测，无抗凝剂4 000 g 离心10 min 分离血清并分装2 份于-20 ℃备用。并对其进行乙肝表面抗原检测。EDTA抗凝剂全血标本用于检测糖化血红蛋白。该研究由广州医科大学附属第三医院伦理委员会批准，伦理批号为：2019007。所有患者均签署了知情同意书。

1.2 仪器设备

BD 流式细胞仪、离心机、酶标仪、BD 自动生化分析仪、雅培I2000 化学发光仪。

1.3 试剂与耗材

化学发光法检测试剂ARCHITECTR HBsAg 购自雅培公司；精浆弹性硬蛋白酶（酶联免疫法）购自深圳华康生物医学工程有限公司；精子核完整性染色试剂购自浙江星博生物科技有限公司；糖化血红蛋白试剂购自Tosoh 公司。

1.4 研究方法

1.4.1精液质量分析 研究对象禁欲2～7 d，手淫法获取精液，精液标本保存在无菌取精杯中，置于37 ℃恒温箱内，待其液化后进行精液常规检查。根据第五版WHO 手册，将精子浓度≥15×106/mL，精子总数≥39×106，精子前向运动≥32%，总活力≥40%，正常精子形态≥4%，认定为正常精液参数参考范围。

1.4.2精子DFI 及HDS 的检测 根据精子核完整性染色试剂说明书（浙江星博生物科技），采用吖啶橙染色法配合流式细胞术检测精子的碎片率及成熟度并计算结果。精子DFI 反映受损精子的比例及精子完整性。操作方法如下：新鲜样本室温液化30 min 后，显微镜观察计数，根据计数的精液浓度，取一定量精液用A 液稀释至100 μL，终浓度为1×106/mL～2×106/mL 的精子细胞；在流式细胞仪进样管中加入100 μL 稀释好的样本，再加入200 μL 的B液（置于冰上操作），准确计时30 s 后，加入600 μL的C 液；流式细胞仪平衡样品线后检测样品，测定至少5 000 个细胞记录并统计。将标本按照DFI 结果分为3 组，分别为精子低碎片率组（组1）：DFI＜15%；精子中等碎片率组（组2）：DFI（15%～30%）及精子高碎片率组（组3）：DFI ＞30%。有研究将DFI＞30%定为精子完整性异常［10］。

1.4.3糖化血红蛋白（HbA1c）及乙肝表面抗原（HBsAg）的检测 全血糖化血红蛋白含量使用罗氏自动生化仪及Tosoh G7 试剂进行测量。采用高效液相色谱（HPLC）分析HbA1c 含量。采用雅培I2000 对血清标本中血清HBsAg 含量进行检测，结果S/CO≥0.05 为阳性。

1.4.4精浆弹性硬蛋白酶的检测 将液化后的精液2 000 g 离心10 min，按试剂说明书采用酶联免疫法检测标准曲线及精液中弹性硬蛋白酶的含量，最后在450 nm/630 nm 双波长检测标准曲线及样本吸光度并计算。结果＞1 000 ng/mL 为阳性，临床意义为确定感染。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 及R 软件3.6.3 版本进行统计分析及作图，韦恩图采用R 软件的Venn 包进行可视化绘制。计量资料首先进行正态性和方差齐性检验。本实验的变量不符合正态分布，因此用中位数（四分位数）表示，采用Kruskal-Wallis 进行非参数方差分析检验；采用Wilcoxon rank sum test 进行两组比较。两组间乙肝表面抗原阳性率采用Fisher 精确检验；两组间精浆弹性硬蛋白酶阳性率进行卡方检验。采用Spearman 的相关系数（r）用于非参数变量间相关性分析并用R 语言corrplot 包进行可视化。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同精子损伤程度组间的临床参数及精液常规结果比较

将142 例男性精液及血液标本按照不同DFI 比例分为3 组：DFI＜15%组1（n=52，33.5 岁）；DFI（15%～30%）为组2（n=69，34 岁）；DFI＞30%为组3（n=21，36 岁）。从表1 可见，组2 的糖化血红蛋白水平高于组1，在DFI＜30% 的前提下，高的血红蛋白水平可能与精子损伤有关。结果显示，精子总数、浓度、前向运动力、总活力和正常形态随着DFI 的升高而降低。

表1 不同亚组临床及精液参数分析

另一方面，表2 显示在组1 中，精液参数正常的比例为56%（29/52），组2 精液参数正常样本比例为35%（24/69），组3 精液参数正常的比例14%（3/21）。值得注意的是，在精液分析参数正常的样本里，有11%（3/56）的患者DFI 异常高（＞30%）。另外在精液参数异常的患者中，21%（18/86）患者的DFI 指数＞30%，73%（63/86）患者DFI%＞15%。其中前向动力与精子碎片率关系，如图1 所示。

图1 韦恩图比较精液前向动力与不同精子碎片率的结果

表2 不同精子碎片率的精液常规结果的比较

2.2 精子DFI 指数与精液分析参数及临床参数相关性分析

图2 结果显示精子碎片率指数与年龄、糖化血红蛋白水平、HDS 呈正相关；并与精液体积、总精子数量、浓度、前向运动力、精子总活力及正常形态呈负相关。

图2 精子损伤指数及精液、临床参数相关性

2.3 不同DFI 间糖化血红蛋白水平分析

糖化血红蛋白显示过去2～3 个月的平均血浆葡萄糖水平。已有文献报道高血糖与活性氧（reactive oxygen species，ROS）、炎症水平相关。而POS 与炎症是精子损伤的主要诱因。如图3 所示，在精子中度（组2）患者的糖化血红蛋白水平高于精子低损伤组（组1），P＜0.05。

图3 精子损伤指数及精液、临床参数相关性

3 讨论

在本研究中，我们通过吖啶橙染色检测精子完整性反映精子碎片率及精子质量，并证明了精子碎片率与传统的精液参数（精子浓度，前向运动力，和形态等）的关系。我们观察到精子DNA 完整性与精子前向运动相关性最强，其次是总活力、总精子数，这与之前研究结果一致［11］。精子DNA 损伤的确切机制尚不明确，但有几种可能性，包括氧化应激，染色质堆积异常并且中止凋亡。过剩的ROS 会导致染色质交联，DNA 链断裂，脂质过氧化并启动细胞凋亡信号通路［12］。有效的补充抗氧化剂及改变生活方式被认为是有效的改善精子质量的方法。

此外我们还研究了精子碎片率与糖化血红蛋白之间的关系，近来也有研究表明糖尿病和肥胖可以影响精子质量，但此方面研究还存在矛盾［13-15］。在我们研究中，DFI 值在15%～30%的糖化血红蛋白水平显著高于DFI＜15%的精子的糖化血红蛋白水平。说明在一定范围内（DFI＜30%），精子碎片率水平随着DFI 升高而升高。但在高DFI 组（DFI＞30%）的糖化水平并没有比前两组更高，说明高碎片组的精子质量可能与血糖以外因素有关。另一方面，由于糖化血红蛋白的值与血糖比变异系数更小，也是影响研究血糖指数与精子碎片率关系的因素之一。以往在研究中也有报道糖尿病及高血糖可以提高不孕的风险，其可能的原因包括高血糖触发的炎症、ROS氧化应激、进而引起DNA 结构变化等［16-18］。下一步，我们将纳入更大人群，血糖水平及相关的随访来进一步研究血糖、体重指数及精子质量的关系。

在测定方法上，吖啶橙染色对辅助生殖的预测价值文献报道结果并不一致，部分原因可能是其传统的玻片染色方法荧光发光不稳定，并且和技术员的主观判断影响。在我们研究中采用的是染色与流式细胞仪结合的方法可以规避这些问题。此外，精子碎片率指数目前没有统一的参考范围，有文献通过生育率等指标将不同方法得到的精子碎片率阈值设为25%～30%不等［19］，还有研究将纳入对象精子碎片率的中位数（14%，彗星实验）作为参考阈值，在我们研究的人群中采用吖啶橙方法得到精子碎片率的中位数为17%，和研究结果接近［20］。由于受精成功率及胎儿出生率受影响较多，而精子质量只是影响其成功率的一个方面。在此研究中我们并没有调查精子碎片率与试管出生率之间的关系。在之后的研究中需要在男科和妇科学科之间进行更多合作并结合精子基因组完整性的起因和影响进行进一步研究，以此确定更加精确的精子碎片率的诊断值。

综上，我们根据本实验室的数据结果，探讨了精子碎片率与精液分析参数的相关性，并分析了影响精子完整性的潜在临床因素，可以帮助临床综合判断患者精子质量并采取更个性化的治疗方案。