硝化应激在神经型犬瘟热疾病发展中的临床意义

朱道仙，刘莉*,陆江，赵学刚，郝福星

(1. 江苏农牧科技职业学院动物医学院，江苏 泰州 225300；2. 江苏农牧科技职业学院宠物科技学院，江苏 泰州 225300)

硝化应激(nitrosative stress)是指在致病因素下，机体产生的过量高活性含氮分子可以导致细胞损伤的病理过程[1]。大量研究表明，硝化应激可以引起多种疾病，包括内皮功能障碍、心血管疾病和神经血管疾病等[2-5]。在脑内一氧化氮(NO)是一种重要神经递质，主要由神经元型一氧化氮合酶(nNOS)合成，同时也是参与硝化应激的重要物质，与神经疾病的发生发展关系密切[6]。

犬瘟热是由犬瘟热病毒(CDV)引起的犬科动物一种常见的病毒性疾病，主要表现为呼吸道症状、消化道症状、皮肤症状和神经症状等。临床研究表明，神经型犬瘟热的死亡率较高，治愈率仅为10%左右[7]。寻找对神经型犬瘟热有早期诊断或预测价值的生物标志物以及治疗新靶点具有重要意义。以前的研究表明，犬科动物的神经系统疾病表现为白色和灰色物质的多发性脱髓鞘损伤，这可能是由于在病毒感染过程中自由基的过度产生和积聚所致[8]。因此，本试验以犬瘟热临床病例为对象，研究硝化应激在神经型犬瘟热病理过程中的作用，探讨血浆和脑脊液中NO、nNOS和神经元特异性烯醇化酶(NSE)水平在神经型犬瘟热临床病例筛选中的应用价值，为神经型犬瘟热诊断与预后提供新方法。

1 材料与方法

1.1 病例资料

选取2018年1月到2019年9月期间，到江苏农牧科技职业学院教学宠物医院就诊的诊断为犬瘟热的患犬155例，剔除随访失败或放弃治疗以及伴有其他疾病的病例(42例)后，出现以下神经症状如震颤或癫痫、肌阵挛、共济失调、四肢轻瘫或瘫痪等患犬纳入神经症状组(NCD)，共37例，其余76例纳入无神经症状组(NNS)。同时选取无犬瘟热健康犬25例作为对照组(CG)。本试验纳入研究犬的基本资料见表1，可以看出，各组犬均以纯种犬为主，性别构成无显著差异，年龄分布于5月龄到7月龄，体重2.5～3.5 kg之间，主要以饲喂商品粮为主。

表1 纳入研究病例的基本特征

1.2 方法

1.2.1 CDV的诊断标准

采集鼻分泌物后，用CDV抗原胶体金诊断试剂盒(购于韩国安捷动物诊断试剂有限公司)对纳入病例进行初步诊断。阳性者进一步进行CDV核酸检测(RT-PCR荧光探针法，试剂盒购于上海研生实业有限公司)，按说明书进行结果判断：Ct值≤35.0，且曲线有明显的指数增长为阳性；35.037 或无Ct值为阴性。

1.2.2 血液样本采集

从桡外侧静脉无菌采血3 mL，转移到含有EDTA抗凝剂的小瓶中后以3 000 r/min，离心15 min，制备血浆并储存在-20 ℃下，备用。

1.2.3 脑脊液采集

用846合剂按0.05 mL/kg肌肉注射麻醉犬后，触摸到枕骨大孔凹陷处，取7号针头(针尖磨钝)，由凹陷顺平行犬嘴的方向小心地刺入小脑延髓池。当针头阻力突然消失时，回抽获得脑脊液，确定脑脊液量方法为每5 kg体重抽取1 mL。抽取后，需向小脑延髓池注入等量的生理盐水，以保证脑脊髓腔内的压力。

1.3 硝化应激指标检测

1.4 数据统计与分析

数据采用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析。结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 硝化应激指标的变化

通过图1可以发现，与CG组比较，NNS组血浆和脑脊液中NO水平显著升高(P<0.05)，NCD组极显著升高(P<0.01)，且NCD组显著高于NNS组(P<0.05)。血浆中nNOS水平变化较大，NCD组的水平最高，NNS组次之，CG组最低，各组间差异显著(P<0.05或P<0.01)。NCD组脑脊液中nNOS水平分别高于NNS组(P<0.05)和CG组(P<0.01)，且均高于各自血浆中水平。犬瘟热感染后脑脊液和血浆中NSE水平均升高，与CG组比较，NNS组差异显著(P<0.05)，NCD组差异极显著(P<0.01)，NCD组与NNS组之间也有显著差异(P<0.05)。

a.NO；b.nNOS；c.NSE

2.2 硝化应激指标对神经型犬瘟热的预测分析

根据不同二分类方式，以灵敏度为纵坐标，以1-特异性为横坐标，分别将血浆中和脑脊液中的各指标进行了ROC曲线分析。可以看出，以NCD组与CG组作二分类分析时，NO、nNOS与NSE的ROC曲线AUC均大于0.5，对神经型犬瘟热具有诊断意义。血浆中nNOS的ROC曲线的AUC最大，灵敏度最高，诊断临界值为195.4 ng/mL(图2a)；脑脊液中NSE的预测作用最好，诊断临界值为2.94 ng/mL(图2c)。以NCD组与NNS组作二分类分析时，NO、nNOS与NSE的ROC曲线AUC有所降低，血浆中nNOS的AUC最大，诊断临界值为230.1 ng/mL(图2b)；脑脊液中NSE最大，诊断临界值为3.67 ng/mL(图2d)。

2.3 硝化应激指标对神经型犬瘟热的预后价值分析

对NCD组的所有病例进行了50 d的随访，并以各个指标的平均值为分割点，将NCD组病例分成2个亚组：低于平均值组(

a、c.NCD组和CG组比较；b、d.NCD组和NNS组比较；a和b为血浆中水平；c和d为脑脊液中水平

a.血浆；b.脑脊液；c.血浆中NSE的生存曲线

3 讨论

犬瘟热是由CDV感染引起的危害犬科、猫科及浣熊科等动物一种疾病，病死率高达80%～90%。近年来，对于犬瘟热的诊断取得很大进展，免疫胶体金技术由于使用方便，价格低廉，已广泛应用于临床，但存在敏感性和特异性略低的缺点[10]。而RT-PCR技术在犬瘟热诊断中具有较高的敏感性和特异性[11]。本研究对于犬瘟热的诊断采用了胶体金技术进行初筛，进一步用RT-PCR验证，提高了纳入病例的准确性。

研究表明，NO是一种极不稳定气体自由基，可引起硝化应激，由NOS催化氧化L-精氨酸合成并释放，在中枢神经系统中主要由nNOS合成，广泛分布于哺乳动物的各种组织中特别是神经组织。NO具有细胞间第二信使作用的多效应分子，其生物学效应具有双重性，已证实低浓度NO在大脑神经调节和神经传递等方面发挥重要作用，当NO过量时，则成为神经毒物，是脑损伤的关键因子，参与多种炎症过程，导致神经元凋亡，诱导疾病发生[12]。神经症状是CDV进入中枢神经引起脱髓鞘性犬瘟热脑炎所致，但发病的分子机制不详。本研究结果发现，神经型犬瘟热病例的脑脊液与血浆中的NO和nNOS水平均高于非神经型犬瘟热和健康犬，说明硝化应激可能是神经型犬瘟热的发病机制之一。ROC曲线显示，不论是脑脊液还是血浆中，NO、nNOS的ROC曲线下面积均大于0.8，对神经型犬瘟热的诊断具有较高的灵敏度和特异性。

NSE存在于脑脊液和全身循环中，可作为检测神经元损伤的标志物[13]。在本研究中，NCD组病例血浆中NSE水平高于NNS和CG组，脑脊液中NSE水平甚至是NNS组的2倍，CG组的5倍，这些结果表明了神经损伤是神经型犬瘟热主要的病理机制。生存曲线分析结果表明神经损伤程度与预后关系密切，NSE水平越高，其死亡率越高，治愈率就越低。因此，可以推断神经型犬瘟热发生发展中伴有神经损伤过程，可能是由于硝化应激造成的，也提示了硝化应激可能成为神经型犬瘟热治疗的新靶点。

综上所述，硝化应激在神经型犬瘟热发展过程中具有重要作用，血浆和脑脊液中的NO、nNOS和NSE可作为该病诊断及预测的生物标志物，而且NSE对该病具有较高的预后价值。