老仓醋发酵过程中品质相关因素动态变化研究

温 希，姚东旺，董 霞，胡永金，唐晓洪，何二平，吴荣书

(1. 云南农业大学 食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2. 云南老仓醋餐饮管理有限公司，云南 昆明 650200)

老仓醋品牌于2009年在云南普洱创立. 其创始人仓茂程以红糖和茶叶为原料，利用天然微生物自然发酵产醋，在此过程中，产生丰富的香味和滋味物质，制作全程中不添加任何色素、甜味剂、酸味剂. 老仓醋味道酸甜可口，发酵液中含有活性微生物及其代谢产物，菌液清澈透明，呈橙黄色，具有清香的果酸味和特殊香气. 发酵过程采用表面静态发酵法，该方法具有易操作、能耗低、适合大规模化生产、原料利用率高、发酵过程易于控制、后续处理快捷方便等优点[1]. 2014年云南老仓醋米线餐饮有限公司成立，其利用老仓醋为饮品，以“一碗米线一碗醋”为特色打造出云南地方特色餐饮品牌，获得大众的喜爱与认可，5年时间发展了百余家门店. 老仓醋作为一种新兴的醋类饮品而非调味品，以佐餐的形式配合米线一起售卖，其独特的口味和食用方式也让前来品尝的消费者赞不绝口. 老仓醋是一种对人体有保健功效的饮料，含有大量机酸及有益微生物，但在传统酿造过程中极易污染杂菌，并且菌相与生化反应错综复杂[2]，存在产酸量低，发酵时间长等问题. 对于不同地域、不同原料、不同工艺生产出的食醋，微生物群落结构及优势菌群各不相同，复杂的物料体系，活跃的微生物代谢活动，这些变化必然引起酿造物料中代谢产物的变化，代谢产物的种类及含量会直接影响到醋的品质，因此有必要对老仓醋发酵过程中理化指标变化及微生物群落结构变化进行研究. 本文拟通过在老仓醋发酵过程中连续取样，对其pH、还原糖、总糖、酒精度、总酸，以及醋衣和醋液中的总菌、醋酸菌、乳酸菌和酵母菌含量的动态变化规律进行系统研究，旨在探明理化风味成分与微生物之间的内在关联，将发酵过程划分为不同阶段，解决产酸量低，发酵时间长等问题. 研究结果为缩短老仓醋发酵周期、提高生产率和稳定产品质量，为促进老仓醋的工业化发展提供科学的理论依据和技术参考.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

（1）样品 从云南老仓醋发酵厂采集样品，随机选取2个发酵池，从发酵第1天开始，到发酵生产结束，每隔3 d取1次样. 分别采集来自两缸中表面的醋衣及表面以下中层处的醋液，每个发酵池取2个醋衣样品及2个醋液样品，每份约500 g于无菌均质袋中，低温运回实验室后置于0～4 ℃冰箱中保存. 为了尽量保证样品中微生物信息的完整性，尽快进行样品微生物分析.

（2）试剂 无水乙醇(分析纯，天津市化学试剂三厂)，蒽酮(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，硫酸 (分析纯，川东化工有限公司)，DNS 试剂(分析纯，福州飞净生物科技有限公司)，葡萄糖(分析纯，合肥博美有限公司)，氢氧化钠(分析纯，天津市化学试剂三厂)等.

（3）仪器 双人单面净化工作台(型号SW-CJ-2D，苏州净化设备有限公司)；电子天平(型号LQA 3002，瑞安市安特称重设备有限公司)；立式压力蒸汽灭菌器(型号LDZX-5OKBS，上海申安有限公司)；恒温水浴锅(型号HWS24，上海一恒科学仪器有限公司)；旋转蒸发器(R206B，上海申生科技有限公司)；分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；数字型pH计(型号STARTER3100/F，上海奥豪斯仪器有限公司)；酒精计等.

（4）计数培养基 PCA平板计数琼脂培养基(广东环凯微生物科技有限公司) 用于菌落总数测定；MRS培养基(广东环凯微生物科技有限公司)用于乳酸菌计数；PDA马铃薯葡萄糖琼脂培养基(广东环凯微生物科技有限公司) 用于酵母菌计数；醋酸菌培养基（酵母膏 1%，葡萄糖1%，无水乙醇4%，碳酸钙 2%，琼脂 2%）用于醋酸菌计数.

1.2 实验方法

1.2.1 理化指标测定

（1）pH 测定 参考 GB 5009. 237—2016《食品pH值的测定》进行pH测定[3]，用酸度计测定pH值，平行测定3次，取平均值.

（2）还原糖测定 采用DNS法测定还原糖质量浓度[4]. 将样品液适当稀释，取稀释后的醋液1 mL于 25 mL 刻度试管中，加 DNS 试剂 1.5 mL，沸水浴 2 min，冷却后用水补足到 25 mL 刻度，在 540 nm波长下测定吸光度. 测定后，取样品的吸光值在标准曲线上计算出相应的还原糖质量浓度.

（3）总糖测定 采用蒽酮硫酸法测定总糖质量浓度[5]. 将样品液适当稀释，吸取1 mL已稀释的醋液于 25 mL试管中，加入 4 mL蒽酮试剂，沸水浴 10 min后取出，用冰浴冷却至室温，在620 nm波长下测定吸光度，测定后，取样品的吸光值在标准曲线上计算出相应的总糖质量浓度.

（4）酒精度测定 参考 GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》[6]，采用酒精计法测定酒精度.称取 100 mL醋液试样置于 500 mL 蒸馏瓶中，加入50 mL 蒸馏水，连接旋转蒸发仪进行蒸馏，待馏出液达到 100 mL时，注入 100 mL 量筒，放入酒精计读取示数，同时记录温度，根据相对密度查表得出结果.

（5）总酸测定 参考 GB 18187—2000《酿造食醋》[7]，采用滴定法测定总酸，结果以醋酸计. 取醋液10 mL 定容至100 mL 容量瓶中，取稀释液20 mL至锥形瓶中，加入60 mL的超纯水及2滴1% 酚酞指示剂，用标准0.1 mol/L氢氧化钠滴定至微红色，计算出总酸度.

1.2.2 微生物计数

（1）菌落总数测定 参考 GB 4789.2—2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》测定菌落总数[8].将醋衣和醋液样品分别稀释后，选择3个适合的稀释梯度，每个稀释度做2个平行，吸取1 mL样品稀释液于无菌平皿内，及时将冷却至46 ℃的PCA培养基倾注至平皿，并转动平皿使其混合均匀. 待平皿凝固后倒置于36 ℃恒温培养箱培养48 h，记录稀释倍数和相应的菌落数量.

（2）醋酸菌分离计数 样品处理同菌落总数的测定，倾注前将碳酸钙和酒精加入培养基中. 待平皿凝固后倒置于35 ℃恒温培养箱培养，72 h后记录稀释倍数和相应的菌落数量.

（3）乳酸菌分离计数 参考 GB 4789. 35—2016《食品微生物学检验 乳酸菌检验》[9]，样品处理同菌落总数的测定. 于平皿中倾注MRS培养基，待其凝固后倒置于36 ℃恒温培养箱培养72 h，记录稀释倍数和相应的菌落数量.

（4）酵母菌计数 参考 GB 4789. 15—2016《食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》[10]，样品处理同菌落总数的测定. 于平皿中倾注PDA培养基，待其凝固后倒置于28 ℃恒温培养箱培养5 d，记录稀释倍数和相应的菌落数量.

2 结果与分析

2.1 老仓醋发酵过程中理化指标的变化

图 1 老仓醋发酵过程中总糖、还原糖的变化Fig. 1 Changes of total sugar and reducing sugar in the fermentation process of Laocang vinegar

2.1.1 老仓醋发酵过程中总糖、还原糖的变化 在发酵起始阶段，选择不同的糖浓度，对发酵醋的品质和风味有很大的影响[11]. 在老仓醋发酵过程中，总糖、还原糖含量的变化趋势如图1所示. 前期由于多糖的水解反应以及还原糖被酵母菌和醋酸菌消耗用于生长繁殖，总糖含量在1～17 d中有明显的下降的趋势，由最初的 13.6 g/100 mL下降到2.4 g/100 mL，在 17 d 后总糖含量下降趋势逐渐平缓. 由于酸不断的积累，微生物生长受到抑制，对糖的需求量减少，在21 d后总糖含量趋近于零. 还原糖含量整体呈现先上升再下降的趋势，在第1～5 天中由 0.36 g/100 mL 迅速上升至 5.87 g/100 mL.此时总糖分解生成还原糖的能力大于酒精发酵所消耗还原糖的能力，使其含量增加，还原糖积累.第5～9 天还原糖含量明显下降，此时微生物大量繁殖，营养物质被快速消耗，还原糖在发酵时作为碳源为酵母菌产生酒精提供原料，同时还原糖也可用于菌体生长，因此还原糖含量减少. 第9～13天还原糖含量基本保持不变. 由于酒精的积累，部分不耐酒精的微生物受到抑制，微生物生长代谢活动减慢，使还原糖的消耗降低. 第13～17天，醋酸菌不仅可以利用酒精产生醋酸，同时能利用还原糖产生醋酸，使还原糖进一步被消耗. 第17～25天，随着发酵的进行，发酵液中的还原糖含量剩余极少.在第25天后，总糖与还原糖两条曲线趋于平行，发酵液中的糖也几乎被消耗殆尽，变化趋势不明显.

2.1.2 老仓醋发酵过程中酒精度的变化 老仓醋发酵过程中酒精度含量的变化趋势如图2所示，酒精含量整体呈现先上升再下降的趋势. 第1～13天酒精度不断上升，酒精含量增长幅度较大. 在前期微生物降解的作用下，由于总糖的分解，还原糖的累积，大量还原糖被酵母菌利用从而转化成酒精，使得酒精度快速上升. 在第13天时酒精度达到最大值，为0.9%，此阶段酵母菌为优势菌，而醋酸菌仍处于生长延迟期[12]，称为酒化阶段. 第13～25天，随着发酵的进行，酒精发酵逐渐减弱，大量酒精被醋酸菌利用转化成醋酸，含量明显减少，此时优势菌种为醋酸菌[13]. 大量醋酸的产生，使酵母菌的生长受到抑制，同时发酵液中能提供酵母菌生长繁殖的还原糖含量较低，酒精的生成率低于转化率，导致酒精度快速下降至0.3%. 第25天后酒精度进一步下降，乙醇和乙酸等物质发生酯化反应而产生香味物质，此阶段称为后熟阶段. 整个发酵过程中酒精度的含量都不高，酵母菌产酒精能力较弱，提供给醋酸菌产酸的酒精较少，酒精快速被利用转化为醋酸，不会大量积累，这可能是导致总酸较低的原因.

图 2 老仓醋发酵过程中酒精度的变化Fig. 2 Changes in alcohol content during fermentation of Laocang vinegar

图 3 老仓醋发酵过程中 pH、总酸的变化Fig. 3 Changes of pH and total acid during fermentation of Laocang vinegar

2.1.3 老仓醋发酵过程中pH、总酸的变化 总酸是发酵醋中最重要的指标之一. 由于传统老仓醋在首批产品发酵结束后，并不完全取出，而是在发酵缸中留有一半成品作为主要的菌种来源，再加入新原料继续发酵，因此样品液在发酵初期就有一定的pH值和酸度. 老仓醋发酵过程中pH、总酸含量的变化趋势如图3所示. 总酸整体呈现先上升再略有下降的趋势，pH反之，两者有机统一，相辅相成.第1～13天，此时为酒化阶段，大部分醋酸菌处于生长延迟期，产酸菌数量较少，醋酸菌作用不明显，使得醋酸含量较低. 酵母菌属于优势菌，但随着酒精度的增加，少量醋酸菌利用酒精产生醋酸，说明了酒化阶段与醋化阶段是同时进行的，酒精不会被大量积累，能够快速地被利用. 此外，由于前期还原糖含量的增加，乳酸菌利用还原糖产生少量乳酸，使总酸含量增加. 挥发性酸决定着醋的香气成分，不挥发性酸则是醋滋味成分的物质基础，而乳酸菌产生的乳酸正是不挥发性酸的主要成分[14]. 第13～25天，酒精发酵逐渐减弱，进入醋化阶段. 酵母细胞本身含有丰富的蛋白质和维生素等营养物质，当酒精发酵完成后，酵母菌菌体留在醋液中，可以作为醋酸菌的营养料，有利于醋的发酵[15]. 以醋酸菌为主的产酸细菌产酸量增多，使得总酸度继续上升[16]，在第25天达到峰值，总酸度由初始的1.42 g/100 mL 上升至 3.36 g/100 mL. 第 25 天后由于酸度不断增加，部分产酸微生物不能够适应低pH值环境而被抑制甚至死亡，使产酸量下降. 同时乙醇和乙酸等物质发生酯化反应，伴随着挥发作用，总酸略有下降，最终平稳在3.16 g/100 mL左右.pH由最初的3.46下降到2.92，最终平稳在3.05左右.

2.2 老仓醋发酵过程中微生物指标的变化

图 4 老仓醋发酵过程中醋液微生物的变化Fig. 4 Changes of microorganism in the fermentation process of Laocang vinegar

2.2.1 老仓醋发酵过程中醋液微生物的变化 由于老仓醋是液体自然发酵，发酵成功与否与醋酸菌、酵母菌、乳酸菌等菌种的优劣和活力有着密不可分的关系. 微生物的种类和数量会直接影响发酵醋的品质和风味，研究微生物动态规律就具有很重要的作用. 醋液指的是老仓醋发酵缸中距表面10～20 cm以下中层处的液体，其微生物动态变化由如图4所示. 老仓醋发酵的周期为33天，第1～13天为酒化阶段，此时酵母菌数量快速上升，在第9天数量达到6.85×106cfu/g，发酵液的酒精含量不断升高. 乳酸菌数量先上升，后由于酒精含量的影响数量略有下降. 醋酸菌含量变化不大，处于生长延迟期. 菌落总数快速增加，由于前期发酵液中营养物质充足，环境适宜，微生物大量繁殖，而后由于酒精的积累，部分不耐酒精的微生物受到抑制或死亡，导致其数量减少. 第13～25天由酒化阶段转化为醋化阶段，酵母菌数量开始下降与醋酸菌数量开始上升处于同一个节点，说明发酵即将过渡到醋化阶段，酒精产生能力明显减弱. 此时醋酸菌数量开始增加，在第 17 天出现峰值，达到 6.3×106cfu/g，随后开始减少. 由于酸度和酒精度的不断上升，此时醋酸菌占绝对优势，酵母菌数量明显减少. 乳酸菌数量与菌落总数变化大致相同，整体数量略有减少，但始终维持在较高水平. 第25天后，经过多种微生物发酵后环境中营养不足，菌落总数不断下降，发酵开始由醋化阶段转入后熟阶段，醋酸及有机酸参与成味物质的形成，减缓了酸对乳酸菌的抑制作用使其数量略有增加. 微生物动态变化反映了微生物在不同时间段表现出的消长规律，说明了发酵过程中优势菌群随时间变化而呈现出交替有序的变化.

图 5 老仓醋发酵过程中醋衣微生物的变化Fig. 5 Changes of surface microorganisms in the fermentation of Laocang vinegar

2.2.2 老仓醋发酵过程中醋衣微生物的变化 醋衣指的是发酵缸中表层的菌膜. 用以酿醋的微生物大部分会产生纤维素，纤维素交织成膜，食醋醋液态发酵时，尤其是静置发酵会产生许多菌膜，在醋液表面漂浮[17]. 老仓醋发酵过程中醋衣微生物的动态变化由图5所示，总体变化规律与醋液相似.从空间分布来看，醋衣中的各类微生物数量均高于醋液，在第9天菌落总数和酵母菌达到峰值，菌落总数约为 7.7×108cfu/g，是醋液的 10 倍左右；酵母菌数量约为3.2×107cfu/g，是醋液的5倍左右，随后略有下降，最后趋于平缓. 醋酸菌在第17天增长到了1×108cfu/g，是醋液是15倍左右，随后开始下降，后期略有升高. 醋衣中乳酸菌峰值出现在第13天，达到 4×108cfu/g，不同于醋液中峰值出现在第17天. 醋衣的酒精度，酸度较醋液低，对微生物的抑制作用相对较弱，并且表层氧气相对充足，为微生物生长繁殖提供充足的条件[18]，但醋衣和醋液中的微生物都处于同一个发酵系统，所以消长规律基本保持一致.

3 讨论

老仓醋利用自然发酵的原理，酿造过程酒化和醋化反应同缸进行，微生物种类和代谢产物复杂多样. 从老仓醋发酵过程中各指标的变化趋势可以看出，其发酵过程可分为3个阶段. 第1～13天为酒化阶段，以酵母菌为主导进行酒精发酵，此阶段发酵液中总糖含量不断被消耗分解，还原糖含量由于多糖的分解先上升，后由于微生物的利用而下降.酵母菌数量快速上升，酒精的含量也在快速上升，均在第13天达到最大值. 同时乳酸菌数量增加，代谢物增多，总酸含量不断上升，pH值下降，部分不耐酒精、酸的微生物生长繁殖受到抑制，乳酸菌数量略有下降. 醋酸菌数量变化不大，处于生长延迟期. 第13～25天为醋化阶段，随着发酵的进行，发酵液中还原糖被微生物利用，含量持续减少，酵母菌产酒精速率小于醋酸菌消耗酒精产醋酸的速率，因此酒精含量明显减少. 此时优势菌种为醋酸菌，大量的醋酸产生，总酸度继续上升，使酵母菌的生长受到抑制，数量减少，而乳酸菌数量变化不大.第25天后为后熟阶段，经过多种微生物的发酵消耗和代谢物之间互相反应后环境中营养成分不足，同时由于酸的不断积累，除部分耐酸的乳酸菌及醋酸菌外，大部分的微生物生长都受到抑制甚至死亡，菌落总数不断下降，酒精和总糖几乎消耗殆尽，酒化、醋化都基本停止. 发酵液中的还原糖、醋酸等有机酸通过美拉德反应、酯化反应等各种生化反应产生食醋中成味物质的如醇、酚、醛、酮等[19].

醋衣与醋液的微生物变化规律相似,但醋衣中各类微生物数量均高于醋液,其中酵母菌是醋液的5倍左右,菌落总数是醋液的10倍左右,醋酸菌是醋液的15倍左右.这是由于醋衣中酒精度、酸度较低,对微生物的抑制作用较弱,并且表层氧气充足,为微生物生长繁殖提供良好的条件[20].长期以来对醋衣的研究很少，醋衣中微生物发酵作用不容忽视，应该引起重视.

本文主要对老仓醋发酵过程中微生物数量及相关理化指标进行跟踪，涉及了微生物的消长变化、还原糖、总糖、pH 值、酸度和酒精度等因素，并对其相互影响作了简要的探讨. 研究为筛选满足各发酵阶段需要的功能性微生物提供了理论依据和数据参考，为进一步探究风味物质的形成机理和调控作铺垫，以便缩短发酵周期，同时提高生产率和产品质量.