培氟沙星均三唑硫醚类化合物抗增殖活性的3D-QSAR研究与分子设计

冯 惠，王晓辉，王 菊，冯长君

(徐州工程学院 材料与化学工程学院，江苏 徐州 221018)

氟喹诺酮药物以喹啉-4-酮-3-羧酸为优势药效团的基本骨架，因其抗菌作用靶标—拓扑异构酶也是抗肿瘤药物的重要作用靶点，由此可通过结构修饰将其抗菌活性转化为抗肿瘤活性. 胡国强等[1-2]课题组成功将氟喹诺酮C-3羧基被等排体如酰腙、唑杂环等所替代，可提高其抗肿瘤活性. 谢玉锁等[3]利用药效团拼合原理，用均三唑杂环作为抗菌培氟沙星(Pefloxacin)C-3羧基的等排体，缩氨基硫脲作为等排体的优化修饰基，成功合成12种培氟沙星C-3均三唑硫醚酮衍生物和12种培氟沙星C-3均三唑硫醚酮缩氨基硫脲衍生物，这24个化合物简称为“培氟沙星均三唑硫醚衍生物”. 他们采用MTT法测定了上述化合物对人白血病细胞(HL60)的体外抗增殖活性.

定量结构−活性相关 (Quantitative Structure-Activity Relationship, QSAR)[4-10]是基于分子结构，运用数理及统计方法研究结构与性能之间数量关系的学科. 徐光宪院士因其涉及化学的根本问题，曾称其为21世纪化学的4个“世纪难题”之一. QSAR在预测化合物生物活性方面已成为化学、医药、环境等学科的热门领域. 在3D-QSAR中最为常用的是1988年Crameretal提出的比较分子力场分析(Comparative Molecular Field Analysis， CoMFA)方法[11-18]，由于引入分子结构的三维构象信息，通常能够获得质量更佳的QSAR模型. 本文基于CoMFA程序建立培氟沙星C-3均三唑硫醚衍生物对人白血病细胞(HL60)体外抗增殖活性(pM)[3]的3DQSAR模型，以揭示影响抗增殖活性的微观结构因素，探讨抑制人白血病细胞(HL60)作用的分子机理.

1 研究对象

谢玉锁等[3]合成的24种培氟沙星均三唑硫醚衍生物的分子基本结构，见图1. 其中取代基R、X见表1. 他们测定了上述化合物对人白血病细胞(HL60)的半数抑制浓度，以“IC50”表示，单位为μmol·L−1，其数值见表 1.

根据物理化学原理，化学反应自由能变与体系平衡浓度为对数关系，故令：

24种合成化合物的pM数据见表1.

图 1 培氟沙星均三唑硫醚衍生物分子的基本结构Fig. 1 Basic structure of pefloxacin isotriazole sulfide derivative molecules

2 建模方法

使用Tripos公司Sybylx2.1.1分子模拟软件建立培氟沙星均三唑硫醚衍生物对人白血病细胞(HL60)体外抗增殖活性的3D-QSAR模型，使用的模块包括 SYBYL、Sketch、Minimize、Databasealignment以及CoMFA的QSAR方法等.

2.1 化合物分子药效构象的确定及分子叠合一般采用分子能量最低的构象代替药效活性构象. 使用 Sybylx2.1.1软件中的 Sketch molecule模块，先构建24个培氟沙星均三唑硫醚衍生物分子[3]和新设计5个分子的初始三维结构；再通过Minimize模块及Tripos力场，加Gasteiger-Huckel电荷以及把最大迭代次数 (Max. Iterations)定为 1 000 等设置，对所有分子进行分子力学能量最低优化. 通过全构象搜索得到能量最低构象，并以此最低能量构象作为分子叠合的生物活性构象.

随机选取分子3、9、16、22、23为测试集(Test set；含 22 号模板分子. 见表 1 中带“*”的分子)，余下20个分子作为训练集(Training set，亦含22号分子). 所谓模板分子是指样本中生物活性最强的分子. 以对HL60细胞体外抗增殖活性最强的22号为模板分子，基于原子契合的公共骨架叠合方式(即尽量保证所有叠合分子取向相同，使分子间相互重叠误差最小)予以叠合. 即以22号分子中的公共骨架，运用Align database模块对训练集、测试集分别进行叠合. 此二集的叠合图见图2，分子间密切重合，叠合效果良好.

2.2 CoMFA 模型的建立采用 Tripos标准力场，对训练集的叠合分子周围每个网格点上的立体场(Steric，St)及静电场 (Electrostatic，El)予以计算场能值. 以体外抗增殖活性为因变量，场能值为自变量，用偏最小二乘法 (Partial Least Squares，PLS)进行建模. 首先采用逐一剔除法 (Leave-One-Out，LOO)进行交叉验证，以获交叉验证系数和最佳主成分数N. 一是以衡量模型的预测能力，要求的模型，其可信度优于95%，或然性小于5%；的模型，统计意义十分显著[19].二是以最佳主成分数N建立非交叉QSAR模型，获得判定系数R2、估计标准误差SD、统计方差比F. 最后采用View CoMFA模块，以三维等势图直观反映立体场和静电场对培氟沙星均三唑硫醚衍生物pM的贡献.

表 1 培氟沙星均三唑硫醚衍生物分子结构与抗增殖活性(pM)Tab. 1 The molecular structures and anti-liver cancer activity(pM) of pefloxacin isotriazole sulfide derivatives

图 2 训练集与测试集的叠合图Fig. 2 The plots of all the aligned molecules in training set(a)and test set(b)

3 结果与讨论

3.1 训练集 pM的 CoMFA模型培氟沙星均三唑硫醚衍生物对HL60细胞体外抗增殖活性pM的3D-QSAR模型见表2，St.、Ele.分别代表立体场及静电场对pM的贡献率.

表 2 训练集 pM的 CoMFA 模型Tab. 2 The CoMFA model of training set for pM

模型质量检验如下：

(2) 非交叉验证部分：①判定系数检验. 根据一般的统计标准, 若要建立一个具有良好拟合性的QSAR 模型，其R2≥0.80[20]. 本研究R2=0.903＞0.80，显示良好的相关性. 由于R2又称为削减误差比例，即该模型包含了影响pM的90.3%以上因素，尚有不足9.7%归于随机因素，故可用于pM的估算与预测. ②显著性检验. 在95%显著水平下，训练集CoMFA模型的F临界值为F0.05(4,15)=3.06. 所建模型的F是其11倍之多，表明模型规定的因果关系显著.

(3)外部预测能力：利用训练集的3D-QSAR模型对测试集中分子的pM进行预测，以检验其外部预测能力. 对pM的预测值见表1，平均绝对预测误差仅为0.152，与相应实验值非常吻合，呈现模型很好的外部预测能力.

3.2 训练集 CoMFA 等势图CoMFA 模型的三维等势图分为立体作用分布图和静电作用分布图.

以化合物22为模板分子的pM的三维立体场等势图见图3(a). 在缩氨基硫脲部位有2个绿色区域，该区域引入体积较大的取代基有助于提高化合物的抗增殖活性. 因此，1～12号化合物没有缩氨基硫脲部分，其抗增殖活性都弱于相应13～24化合物. 另外，在苯环的3,4-位之间有个黄色区域，该区域引入体积小的基团会使化合物的抗增殖活性增强. 例如 6、18 的 3,4-位为 OCH2，7、19 的 3,4-位为CH3O，其抗增殖活性均比2～5、14～17弱.

以化合物22为模板分子的pM的三维静电场等势图见图3(b). 在缩氨基硫脲部位有个靠近氨基中氢原子较大的蓝色区域，以及靠近硫原子较小的蓝色区域. 在此区域引入正电性基团利于生物活性最强. 因此，后12个化合物的抗增殖活性都强于(相应)前12个化合物. 在苯环的3,4-位之间有个红色区域，此区域处引入负电性取代基有助于增强化合物的生物活性. 例如4-位上氟原子是最强的负电性基团，故10号在前12个化合物中、22号在后12个化合物均有最强的抗增殖活性.

图 3 CoMFA 模型的立体场与静电场等势图Fig. 3 CoMFA contour maps. (a) steric field; (b) electrostatic field

此模型显示立体场和静电场对pM的贡献分别为71.8%和28.2%，可见取代基的立体作用强于静电作用2倍多. 即pM主要取决于取代基的立体场，即3,4-位引入小体积基团的分子，与靶标生物大分子提供的空穴很好契合，空间位阻小而利于提高对HL60细胞体外抗增殖活性. 其静电作用一般包含库仑力、氢键及配位. 3,4-位上体积较小的负电性基团F具备与靶标形成库仑力、氢键及配位的必备条件，因此，10号分子在前12个分子、22号在后12个分子中均是最强的抗增殖活性.

3.3 分子设计 QSAR研究目的之一是根据所建模型中隐含的影响生物活性的主要结构信息进行分子设计. 由3.2节分析可知，在苯环的3,4-位上引入小体积的负电性基团，有利于增强培氟沙星均三唑硫醚衍生物对HL60细胞体外抗增殖活性. 据此设计5个化合物(见表1中第25～29号化合物)，3D-QSAR模型给出的pM预测值在5.322～5.519之间，均优于22号分子预测值(5.149).

4 结论

(1) 基于比较分子力场方法(CoMFA)建立培氟沙星均三唑硫醚衍生物对人白血病细胞(HL60)体外抗增殖活性的 3D-QSAR 模型：= 0.436，R2= 0.903，F=34.89，显示优良的鲁棒性、拟合性和预测能力.

(2) CoMFA模型三维等势图显示在苯环的3,4-位上引入小体积的负电性基团，有利于增强培氟沙星均三唑硫醚衍生物对HL60细胞的抗增殖活性.据此设计的5个化合物，显示较大的pM预测值，有待生物医学实验确认.