海豹油n-3PUFA富集过程中品质及挥发性物质的变化

郑振霄，戴志远*，彭 茜

（1 浙江工商大学海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江工商大学 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 杭州310012 3 浙江工商大学 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心 杭州310012）

海豹（Phoca hispida）是对鳍足亚目种海豹科动物的统称。海豹主要分布在寒冷的两极海域，大体分成北方的海豹亚科和南方的僧海豹亚科2类，其中海豹亚科分布基本限于北半球，而僧海豹亚科在2 个半球均有分布。极寒的生存环境，使得海豹脂肪组成具有特异性。一个最大的特征就是n-3 多不饱和脂肪酸（n-3PUFA）含量高。研究表明n-3PUFA 在促进炎症消退，调节体内脂代谢，增强免疫力等方面具有积极作用。此外，海豹脂肪组织中还含有一种鱼体中罕有的增效因子——DPA，可以一定程度上增强EPA 等n-3PUFA 的功效。海豹油提取自海豹脂肪组织的液体脂肪油，在常温下呈淡黄色，具有重大开发潜力[1-4]。

海豹油中n-3PUFA（EPA，DPA，DHA）的含量通常在20%左右，在此浓度所起到的保健功能非常有限，通常情况下，只有含量在70%以上，n-3PUFA 的保健功能才能得到充分发挥，因此有必要采取一定技术手段对其中的n-3PUFA 进行富集。由于油脂的天然存在形式是甘油三酯，而甘油三酯的沸点较高，且其所连接的脂肪酸具有异质性，使得n-3PUFA 的富集存在较大阻碍，乙酯化油则可以有效回避上述阻碍，适合作为制备高纯度n-3PUFA 的原料[5]。对于酯化油来讲，尿包法和分子蒸馏法是比较常用的n-3PUFA 富集方法，尿素包合法是依据不同脂肪酸碳链的平均直径程度来分离的方法，而分子蒸馏法是根据不同脂肪酸在真空状态下，挥发性不同而进行分离的方法，这2 种富集方法的共同特点就是操作简便，经济实惠，非常适合工业化生产[6]。

目前，对于尿包法和分子蒸馏法的研究主要集中在工艺参数的优化和反应条件的改善2 个方面。Zhang 等[7]以裂殖壶藻油乙酯为原料，利用分子蒸馏技术对其中的n-3PUFA 进行富集，结果表明，在蒸发温度110.4 ℃，进料速率78.7 mL/h，刮板转速350 r/min，压力10 Pa 的条件下，重相中n-3PUFA 含量可达92.98%。Zheng 等[8]采用尿素包合法对海豹油乙酯中的n-3PUFA 进行富集，采用响应面法优化富集条件（尿酯比、结晶温度和结晶时间），最终得到n-3PUFA 质量分数为71.35%的脂肪酸乙酯混合物，得率为82.31%。林文等[9]采用尿素包合法和分子蒸馏法对乙酯型鱼油中的EPA和DHA 进行富集，结果表明，在最优条件下，EPA和DHA 的总纯度达78.90%，回收率为49.00%。关于尿包和分子蒸馏对油脂品质及挥发性物质影响的研究较为少见。本文以海豹油乙酯为原料，采用尿包法和分子蒸馏法对其中的n-3PUFA 进行富集，并通过理化分析、气相色谱（GC）及顶空固相微萃取-气质联用（HS-SPME-GC-MS）等技术研究尿包法和分子蒸馏法对海豹油乙酯品质、脂肪酸组成及挥发性物质的影响，以期为功能性海豹油生产过程中的品质控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海豹油乙酯，舟山市奥旭鱼油制品有限公司；正己烷、乙醇等，国药集团；脂肪酸乙酯标准品，上海安普科学仪器有限公司。

1.2 仪器与设备

磁力搅拌器，常州国华电器有限公司；分子蒸馏器，天津尧舜分子蒸馏设备有限公司；水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；7890B 气相色谱仪，美国Agilent 公司；Trace GC Ultra 气相色谱与DSQ Ⅱ质谱联用仪，美国Thermo Fisher Scientific 公司。

1.3 尿素包合法联合分子蒸馏法富集n-3PUFA

尿素包合法的主要工艺参数：尿酯比2.38∶1，冷却温度15 ℃，时间2.5 h，分子蒸馏法的主要工艺参数：进样量250 g，蒸馏温度90 ℃，压力2.0 Pa。具体操作流程参考文献[10]所述方法。

1.4 品质指标的测定

品质指标包括水分及挥发物、酸价、皂化值、过氧化物值和碘值，测定方法参考文献[11]所述。

1.5 脂肪酸组成的测定

采用气相色谱检测，检测条件参考文献[11]所述。

1.6 挥发性物质的测定

挥发性物质的萃取采用顶空固相微萃取技术，挥发性物质种类和相对含量的测定由GC-MS完成[12-13]。

2 结果与分析

2.1 品质指标

富集过程中海豹油的品质指标变化如表1所示。酯化油、尿包油和分子蒸馏油中的水分及挥发性物质的含量分别为0.48%，1.66%和0.21%。由于尿包过程中涉及到“水洗”，这一过程会明显增加样品中的水分含量，分子蒸馏是在高真空和较高温度条件下实施的分离方法，水和一些低沸点的化合物会在这一过程中被去除。油脂是疏水性的物质，一般情况下油水不易混溶，而油脂中的磷脂、固醇等杂质能吸收水分，并形成胶体物质悬浮在油脂中，油脂中的水分和挥发性物质含量过多，会促进油脂中解脂酶的活动以及微生物的生长、繁殖，加快油脂的水解和酸败[14-15]。酸价是指中和1 g 油脂中游离脂肪酸所需KOH 的质量，是反映油脂品质的主要技术指标之一，酸价越高，油脂水解越严重，品质越差[16]。酯化油、尿包油及分子蒸馏油的酸价分别为0.84，0.79，0.81 mg KOH/g，统计学结果显示三者之间没有显著差别（P＜0.05），这说明尿包法和分子蒸馏法对海豹油乙酯的酸价没有影响，并且在整个n-3PUFA 的富集操作过程中酸价始终保持在较低水平。华盛顿责任营养委员会规定功能油脂中的酸价限量为＜3 mg KOH/g，说明在整个富集过程中，海豹油的酸价始终维持在较低水平。油脂的皂化值是油脂本身的特性，是完全造化1 g 油脂所需的KOH 的mg 数，是油脂中脂肪酸平均链长的量度，与油脂的平均分子质量紧密相关[10]。酯化油、尿包油和分子蒸馏油的皂化值分别为177.73，200.48，250.53 mg KOH/g，呈逐渐增大的趋势，这是因为在尿素包合和分子蒸馏过程中，结构简单的直链脂肪酸和沸点较低的脂肪酸会被分离，长链的结构复杂并且具有较高沸点的脂肪酸通常具有较大的平均分子质量，表观反映为皂化值的不断增大。油脂过氧化物值是判断油脂及其制品氧化程度的重要指标，主要反映油脂中氢过氧化物的含量，是评价油脂品质的重要依据。酯化油、尿包油和分子蒸馏油的过氧化物值分别为4.22，4.25，4.35 meq/kg，三者之间没有显著差异，说明尿包和分子蒸馏对样品的过氧化值的影响不大。碘值反映油脂不饱和程度，酯化油的碘值为116.63 g I2/100g，小于尿包油（163.73 g I2/100 g），尿包油小于分子蒸馏油（200.89 g I2/100g）。结果表明，随着尿包和分子蒸馏操作的进行，样品的不饱和度越来越大，说明尿包法和分子蒸馏法是富集n-3PUFA 的有效手段。

表1 富集过程中的品质指标变化Table 1 The change of quality index during enrichment

2.2 脂肪酸组成

n-3PUFA 富集过程中脂肪酸的组成变化如图1所示。酯化油中的脂肪酸组成比较复杂，含有多种不同种类的脂肪酸。其中，单不饱和脂肪酸（MUFA）含量最高达48.32%，饱和脂肪酸（SFA）和n-3PUFA 的含量较为接近，分别为24.15%和22.05%，相似的结果也出现在Durnford 等[17]的报道中。SFA 中，棕榈酸（C16：0）的含量最高，为13.72%，其次为肉豆蔻酸（C14：0），6.64%；MUFA 中，油酸（C18：1）的含量最高，达到21.74%，其次为棕榈油酸（C16：1），15.11%。n-3PUFA 中，DHA 的含量最高，为9.33%，其次为EPA（8.87%），DPA 的含量为3.85%。

尿包油中SFA，MUFA 和n-3PUFA 的含量分别为4.22%，24.81%和62.52%。相比于原料油，SFA 含量下降最为显著（下降到起始含量的1/5），MUFA 含量下降也较明显（下降至起始含量的1/2），PUFA 含量大幅度增加（约为起始含量的3倍）。对比不同种类脂肪酸的含量变化可以看出，尿包法可以有效去除样品中的SFA。然而，对于某些长链MUFA 的分离效果来讲，作用有限，尤其是C16：1（11.56%），C18：1（7.61%）和C20：1（5.64%），仍 占据较大比例。DHA、EPA 和DPA 的含量显著升高，分别为起始值的2.91，2.87，2.57 倍，可以看出，尿素包合法对DHA 和EPA 的富集效果要好于DPA，然而，两者之间的差别不大。在尿素六面体结构形成结晶过程中，饱和脂肪酸由于其碳链为直链结构，容易形成尿素络合物而被分离，而高不饱和脂肪酸由于其含有多个双键，碳链弯曲程度高，很难被晶体结构包合而得到富集，并且这种富集效果会随着结构的复杂程度增加而增强[18]。DHA、EPA 和DPA 是二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸的简称，按结构的复杂程度排序为DHA＞DPA＞EPA。然而从数据上看，DPA的富集效果逊于EPA，可能与原料中DPA 的含量较低有关，原料中DHA 和EPA 的含量较为接近，而DPA 的含量远低于另外两者。

分子蒸馏后的样品中共检测到5 种脂肪酸，分别是C20：1（4.68%），C22：1（2.21%），EPA（17.37%），DPA（21.24%）和DHA（54.35%）。尿包后残存的SFA 经过分子蒸馏已被完全去除，MUFA 中C16：1和C18：1的含量也被降低至检测限以下，只有少部分分子质量较大的MUFA（C20：1和C22：1），然而其含量也都在5%以下。对于EPA、DPA 和DHA 来讲，EPA 含量出现大幅下降，从25.44%降低到17.37%，DHA 和DPA 的含量大幅提升，分别由27.15%，9.93%提高到54.35%和21.24%，增幅为1.00 倍和1.14 倍。对于三者含量在分子蒸馏过程中的不同表现，可以解释为EPA 的分子质量与其它两者差别较大，导致其沸点最低，分子自由程最低，因此在蒸发和冷凝过程中会先于其它两者被分配到轻相中，EPA 含量降低导致其它2 者含量上升。

2.3 挥发性物质

HS-SPME-GC-MS 是测定挥发性物质的一种常用手段，既具有准确性高，选择性好，鉴别能力强的特点，又具有所需样品少，灵敏度高的特点[19]。许多学者都采用该方法研究油脂中的挥发性物质。王亚男等[20]采用GC-MS 方法研究超临界萃取得到的金枪鱼油中的挥发性物质，发现鱼油中的主要挥发性物质为酸类、醛类、烃类、酮类及一些杂环化合物。李文佳[21]利用GC-MS 测定淡水鱼油中的挥发性物质，分析结果表明醛类是淡水鱼油中的主要挥发性物质，占总挥发性物质的45.26%。

图1 富集过程中脂肪酸组成变化Fig.1 The fatty acids composition changes during the enrichment

图2 富集过程中挥发性物质种类变化Fig.2 The types of volatile substances changesduring the enrichment

本试验采取HS-SPME-GC-MS 方法对酯化油、尿包油和分子蒸馏油中的挥发性物质种类和含量进行测定，并对不同种类挥发性物质的峰数量和峰面积进行分析。海豹油中挥发性物质的种类及数量如图2所示，海豹油酯化油、尿包油及分子蒸馏油中检测到的有效成分分别为40，42，41种，酯化油中检测到种类较多的物质是酮类（10种）、醛类（8 种）、烃类（7 种），而尿包油中种类较多的物质为醇类（10 种）、醛类（8 种）、烃类（8种），分子蒸馏后的样品中检测到种类较多的物质为醇类（10 种）、酮类（9 种）、醛类（7 种）。根据检测到挥发性物质的种类、数来看，尿包法和分子蒸馏法对海豹油乙酯中的挥发性物质的影响不是很大，并且样品中风味物质多数被鉴定为醛类、酮类、醇类和烃类。

酯化油、尿包油和分子蒸馏油中的挥发性物质的种类及相对含量如图3～图5所示。酯化油、尿包油及分子蒸馏油中挥发性物质的总峰面积分别为71.66%，84.69%，63.66%，尿包后样品中挥发性物质的总峰面积出现了较大幅度的上升，而分子蒸馏后挥发性物质的面积又明显下降，并且低于酯化油的总峰面积。尿包过程中会使用较多的有机试剂和尿素，这些物质在加热的条件下容易发生分解反应，生成易挥发的物质，使得尿包样品中挥发性物质的总峰面积增加，而分子蒸馏是在高真空度、较高温度下分离，这样的操作条件使得一些低沸点的物质被分离到轻相从而被去除，使得重相中样品的挥发性物质含量减少，因此，分子蒸馏技术不仅可以用作n-3PUFA 的富集，还可用于油脂生产过程中的脱臭、脱色环节。

图3 酯化油中挥发性物质的相对含量Fig.3 The relative content of volatile substances in the ethyl esters

图4 尿包油中挥发性物质的相对含量Fig.4 The relative content of volatile substances in the ethyl esters of urea complexation

图5 分子蒸馏油中挥发性物质的相对含量Fig.5 The relative content of volatile substances in the ethyl esters of molecular distillation

酯化油中相对含量最多的挥发性物质为醛类，占20.44%，其中贡献较大的是十一醛（5.98%）、壬醛（4.15%）和2，4-庚二烯醛（3.14%）；其次是酮类，占17.77%，其中贡献较大的有2-庚酮（4.56%）、2-壬酮（3.97%）、3，5-辛二烯-2-酮（2.62%）；酯化油中烃类的相对含量为11.99%，贡献较大的有乙烯（3.92%）、2，6，10-三甲基十四烷（3.23%）和2，6，10-三甲基十六烷（2.10%）。尿包油中相对含量最多的挥发性物质为醇类，占30.11%，其中贡献较大的为十五碳烯醇（14.42%）、乙醇（6.40%）和2-乙基己醇（3.98%）；其次为醛类，占18.24%，贡献较大的有壬醛（6.16%）、2，4-庚二烯醛（4.00%）和十一醛（3.52%）；再次为酮类，占13.98%，其中贡献较大的有2-庚酮（3.78%）、2-羟基环十五酮（3.69%）和3，5-辛二烯-2-酮（3.69%）。分子蒸馏油中相对含量较多的挥发性物质为烃类（15.79%）、醛类（15.47%）和醇类（15.34%），其中贡献较大的有8-甲基癸烷（3.55%）、7-亚丙基-二环庚烷（3.32%）、1-丙基环己烯（2.94%）、2，4-庚二烯醛（8.83%）、壬醛（1.98%）、十一醛（1.76%）、乙醇（3.03%）、1-戊烯-3-醇（2.62%）、表蓝桉醇（1.78%）。

样品中的烃类化合物主要来自烷基自由基的脂肪酸自氧化，尽管烃类在3 种样品中都占有一定比例，而这些物质的感觉阈值较大，对样品整体挥发性风味的影响不大[22]。醛类、酮类和醇类是烃类化合物不同氧化阶段的不同产物，这些物质通常具有较低的感觉阈值，对样品的主体风味有着很重要的影响[23]。酯化油、尿包油和分子蒸馏油中醛类、酮类和醇类物质的含量分别为52.80%，62.33%和39.92%，尿包之后三者的相对含量显著升高，而分子蒸馏之后又显著下降，并且低于酯化油原料。这一结论与前文总峰面积变化的结论具有一致性，在这一过程中变化较大的风味物质主要有乙醇（3.99%，6.40%，3.03%）、2-乙基己醇（1.25%，3.98%，1.12%）、十五碳烯醇（0.78%，14.42%，1.61%）、壬醛（4.15%，6.16%，1.98%）、十一醛（5.98%，3.52%，1.76%）、3，5-辛二烯-2-酮（2.62%，3.26%，2.86%）、2-壬酮（3.97%，3.25%，1.57%）、2-庚酮（4.56%，3.78%，1.85%）。2-乙基己醇是一种无色液体，本身对样品的主体风味影响较小，而2-乙基己醇可通过乙醛缩合制得，与样品中乙醛含量具有较大关联。壬醛是一种无色油状液滴，具有玫瑰、柑橘等香气，有强烈的油脂气味，存在于红茶、绿茶、烟叶中。十一醛广泛存在于甜橙、柠檬等柑橘水果中，具有脂蜡气和甜橙玫瑰花香，略有甜味，可通过十一醇氧化，或十一酸催化还原制得，亦可通过十一烯酸甲酯加氢后得十一醇催化脱氢制得。广泛应用在化妆品、皂用香精中。3，5-辛二烯-2-酮具有特殊的皂香、蜡香和奶油香，在油脂含量高的食物中分布较广。2-壬酮是一种无色至淡黄色液体，具有甜香、果香、奶油香，天然存在于香料、烟叶、草莓、干酪、生姜中，是一种常用食品香味剂，可用做溶剂、有机合成中间体或制备香料物质。2-庚酮又称甲基戊基酮，是一种无色液体，有类似梨的水果香味，溶于水，广泛用于工业溶剂、纤维、医药、农药、香料化工等领域。

3 结论

尿包和分子蒸馏过程中，伴随着n-3PUFA 含量的不断升高，样品的平均分子质量、不饱和度均大幅增加，表现为皂化值和碘值的不断升高，两者变化过程分别为177.73，200.48，250.53 mg KOH/g和116.63，163.73，200.89 g I2/100 g。尿包过程涉及到“水洗”，所以样品经尿包后水分及挥发性物质含量显著升高（0.48%升至1.66%），而分子蒸馏是在高真空度，较高温度下操作，可以有效降低样品中的水分及挥发性物质的含量（1.66%降至0.21%）。尿包和分子蒸馏操作对样品的酸价和过氧化物值的影响不显著。酯化油原料中MUFA 的含量最高为48.32%，SFA 和n-3PUFA 的含量较为接近，分别为24.15%和22.05%。尿包后样品中的SFA 含量大幅度下降（4.22%），MUFA 含量也明显下降，而某些长链MUFA 仍占据较大比例，如C16：1（11.56%），C18：1（7.61%）和C20：1（5.64%）。分子蒸馏可以有效分离SFA 和MUFA，得到含量高达92.96%的n-3PUFA 浓缩产物。酯化油、尿包油和分子蒸馏油中分别检测到40，42，41 种挥发性物质，挥发性物质的总峰面积分别为71.66%，84.69%，63.66%，结果表明，尿包可以显著增加样品中挥发性物质的含量，而分子蒸馏则可以显著降低挥发性物质的含量，而尿包和分子蒸馏对样品中挥发性物质种类影响不大。其中，变化较大的挥发性物质主要为乙醇（3.99%，6.40%，3.03%）、2-乙基己醇（1.25%，3.98%，1.12%）、十五碳烯醇（0.78%，14.42%，1.61%）、壬 醛（4.15%，6.16%，1.98%）、十一醛（5.98%，3.52%，1.76%）、3，5-辛二烯-2-酮（2.62%，3.26%，2.86%）、2-壬酮（3.97%，3.25%，1.57%）、2-庚酮（4.56%，3.78%，1.85%）。