海参低温贮藏过程中品质与理化性质的变化

白 颖，冯丁丁，浦 源，申 平，时逸馨，奚 倩，董秀芳，启 航*

（1 大连工业大学食品学院 辽宁大连116034 2 国家海洋食品工程技术研究中心 辽宁大连116034 3 塔里木大学生命科学学院 新疆阿拉尔843300）

海参（Stichopus japonicus）是一种重要的海洋棘皮类动物，其体壁上含多种活性物质，如海参多糖和胶原蛋白等成分，具有多种生理及药理活性，是营养价值极高、具有保健作用的食品[1-3]。2018年我国的海参产量达到17.4 万t[4]。海参自身的内源酶使其具有较强的自溶现象，在贮藏过程中容易发生品质劣变，使得质构改变，营养价值降低。

近年来，内源酶中的组织蛋白酶（Cathepsin）家族和半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族成为研究重点。组织蛋白酶-L（Cathepsin-L）及半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）对于肉制品的品质变化有重要影响。2010年，Fontanesi 等[5]研究发现意大利白猪肉的品质与Cathepsin-L 和Cathepsin-S 相关联，这两种内源酶会对肉的嫩度、弹性产生影响。2011年，Huang 等[6]以鸡肌为原料提取肌原纤维蛋白，在25 ℃条件下，用EDTA 或EGTA 加Caspase-3 培养液培养16 h 后，检测肌肉蛋白降解和肌原纤维的超微结构，结果发现激活的Caspase-3能降解鸡肉肌原纤维蛋白，并破坏肌原纤维的结构。海参因含有丰富的内源酶而具有较强的自溶能力[7]，因此对海参中内源酶的研究十分必要。

本研究以海参为原材料，考察其在4 ℃长期贮藏过程中理化性质的变化。通过可溶性胶原蛋白含量、硬度、咀嚼度、蛋白质降解、组织蛋白酶-L活性、Caspase-3 活性、结构蛋白表达量及自由基的生成等指标变化，从自由基层面、分子蛋白层面揭示海参品质的变化，为海参贮藏、保鲜提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料 鲜活的海参（Stichopus japonicus），质量约（140±10）g，大连市刘家桥市场。

1.1.2 主要试剂 Ac-DEVD-PNA、3-[（3-胆固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS）、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、苯甲基磺酰氟（PMSF），美国Sigma 公司；四甲基乙二胺（TEMED）、十二烷基硫酸钠（SDS）、聚丙烯酰胺（Acry）、过硫酸铵（APS）、二硫苏糖醇（DTT）、抑肽酶（Aprotinin）、亮抑肽酶（Leupeptin），上海生工生物工程有限公司；二甲基亚砜（DMSO），国药集团化学试剂有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA），生工生物工程（上海）股份有限公司；β-actin 抗体，细胞信号技术公司；其它试剂均为国产分析纯级。

1.2 主要仪器及设备

TA.XT.plus 物性测试仪，英国SMS 公司；AE-6500 垂直电泳槽、AE-8135 电泳仪电源，日本ATTO 公司；MF-ChemiBIS 2.0 凝胶成像仪，以色列DNR 公司；ZKBTES-55 型真空冷冻干燥机，美国Virtis 公司；A200 型电子自旋共振波谱仪（ESR），德国BRUKER 公司；T25 数显匀浆机，德国IKA 集团；170-3940 半干转印槽，美国Bio-RAD 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理 将20 只新鲜的海参宰杀去脏、去筋，分割成块，每3～5 块分装于玻璃皿中置于4 ℃冰箱，分别放置1，5，10，15，25，30，60 d，没有经过任何处理的新鲜海参作为对照，-80 ℃冰箱中储存备用。另外，将预处理好的整只海参于相同条件下拍照，记录其形态变化。

1.3.2 可溶性胶原蛋白含量的测定 称取不同处理时间的海参各10 g，加入10 mL 蒸馏水，置于80 ℃水浴锅中水浴2 h（每隔30 min 摇匀1 次），于1 500×g 离心30 min，所得上清液用滤纸过滤，取0.5 mL 滤液加入水解管中，再加3 mL 3.5 mol/L 硫酸，于105 ℃烘箱中水解16 h，取出冷却至室温，加水定容至5 mL，混匀，取1 mL 上述溶液过滤，然后加入1 mL 3 mol/L 的NaOH 溶液，混匀，取0.5 mL 置于1.5 mL EP 管内，加入0.25 mL 氧化液（含50 mmol/L 氯胺T 水合物，156 mmol/L柠檬酸，375 mmol/L NaOH，661 mmol/L 乙酸钠，29%（体积分数）异丙醇，pH 6），混匀。室温放置20 min 后，加入0.25 mL 显色液〔含246 mmol/L对二甲氨基苯甲醛，35%（体积分数） 高氯酸，65%（体积分数）异丙醇〕，混匀后用锡纸包好置于60℃放置15 min，再用流水冷却3 min，取200 μL用酶标仪测定558 nm 波长下的吸光值，代入标准曲线（y=0.0721x+0.0591，R2=0.999）求含量。

1.3.3 质构的测定 不同处理时间的海参各取3～5 块（约1.5 cm×1.5 cm）进行TPA（Texture profile analysis）分析。样品置于测试平台上，于室温下测定。TPA 测试探头为P/50。测试条件：测前速率、测试速率与测后速率均为1 mm/s；压缩程度70%；停留间隔5 s；触发值5 g。

1.3.4 蛋白降解情况的测定 取不同处理时间的海参体壁组织适量，按照质量分数为33.3%的比例加入裂解液（含20 mmol/L pH 7.4 的Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA-2Na，10 mmol/L DTT，1%Triton X-100，0.1%SDS），冰浴条件下研磨，提取全蛋白，然后4 ℃，12 000×g 条件下离心15 min。根据样品的蛋白质浓度用SDSPAGE 的5×上样缓冲液（含0.25mol/L pH 7.5 的Tris-HCl，8 mol/L 尿素，5%SDS，5%β-巯基乙醇）按一定比例稀释，沸水浴煮5 min，冷却后离心。使用5%浓缩胶和10%分离胶跑电泳。电泳结束后将凝胶取出，切胶，用考马斯亮蓝R-250 染液染色过夜。脱色液脱色约1 h，倒入一半脱色液和一半水，脱色1 h，最后用凝胶成像仪的可见光成像系统成像。

1.3.5 组织蛋白酶-L（CL）活力的测定 取不同处理时间的海参体壁组织适量，按照1∶3 的质量比加入提取液（含50 mmol/L pH 7.0 的磷酸盐缓冲液，1 mmol/L EDTA，0.1%Triton X-100），冰浴条件下研磨，然后离心10 min（4 ℃，10 000×g），上清液即为待测样液。取待测样液50 μL，加入反应缓冲液（340 mmol/L 乙酸钠，60 mmol/L 乙酸，4 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠，8 mmol/L DTT）25 μL和20 μmol/L 底物（Z-Phe-Arg-Mec）25 μL，混匀后37 ℃水浴15 min；设置空白对照组，取待测样液50 μL，加入100 μL 终止液（含0.1 mol/L 的乙酸-乙酸钠缓冲液，0.1 mol/L 氯乙酸） 和25 μL 20 μmol/L 底物，同样混匀后37 ℃水浴15 min；之后加100 μL 终止液于样品组终止反应，加25 μL 反应缓冲液于空白对照组，用荧光分光光度计（激发波长380 nm，发射波长460 nm）测定酶活力。以每mg 蛋白荧光值的差值比较组间CL 活力的变化。

1.3.6 Caspase-3 活力的测定 不同处理时间的海参体壁组织适量，将其与Caspase-3 提取液（含25 mmol/L pH 7.4 的HEPES，5 mmol/L EDTA，5 mmol/L EGTA，1 mmol/L MgCl2，5 mmol/L DTT，1 μmol/L 胃蛋白酶抑制剂，1 mmol/L PMSF） 按1∶3的质量比添加，冰浴条件下研磨，离心15 min（4℃，10 000 r/min），获得的上清液即所需酶液。在酶标板中加入10 μL 待测酶液，80 μL 分析液（含20 mmol/L pH 7.4 的HEPES，5 mmol/L EDTA，50 mmol/L DTT，1%CHAPS）和10 μL 底物（Ac-DEVD-PNA），对照组加入10 μL 待测酶液和90 μL 分析液，于37 ℃条件下，分别反应0 min 和30 min，并测定405 nm 波长处的吸光值。

1.3.7 Western 免疫印迹 取不同处理时间的海参体壁组织适量，按照1∶3 的质量比加入裂解液（含20 mmol/L pH 7.4 的Tris-HCl，2 mmol/L EGTA，2 mmol/L EDTA-2Na，150 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，0.1%SDS，10 mmol/L DTT，1 mmol/L NaVO3，10 mmol/L NaF，10 μg/mL 抑肽酶，10 μg/mL 亮肽酶，1 mmol/L PMSF），冰浴条件下研磨，离心15 min（4 ℃，12 000×g），取上清液做SDS-PAGE 测定，结束后，组装转印系统（需排气泡），于10 V 恒压条件下转印35 min，转印后进行肌动蛋白（Actin）的一抗孵育，清洗，二抗孵育及显色反应。

1.3.8 自由基的测定 将低温处理后的海参直接冻干，制备冻干粉，然后将其填入石英样品管中，保证每个样品的填充量一致。通过ESR 检测自由基生成情况，检测条件：微波功率6.10 mW，中心磁场3.460 G，转换时间480 ms，扫描宽度200 G，调制幅度1 G，调制频率100 kHz，时间常数5 242.88 ms。

1.3.9 数据统计分析 试验数据以3 个平行组数据的平均值表示，并且计算标准差；用SPSS 软件对数据进行统计分析，采用单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 差异显著。

2 结果与分析

2.1 海参形态的变化

海参在4 ℃处理条件下的形态变化如图1所示，处理1 d 时，海参体型明显增大；处理5 d 时，海参继续向外延伸，而形态完整。随着处理时间的延长，海参体壁开始鼓泡，出现化皮现象，瘫软变得明显，海参体壁上的刺不断分解。处理20 d 时，海参已经铺满整个平皿，海参体壁内皮组织向外翻，可明显看到白色内皮组织。20～25 d 处理期间，海参体壁组织变化不显著，化皮现象有轻微加重。30 d 之后的海参严重损伤，已经失去完整形态，刺完全消失，表皮变黏。

图1 在4 ℃贮藏条件下海参形态的变化Fig.1 Morphological changes of sea cucumber at 4 ℃storage conditions

2.2 可溶性胶原蛋白含量的变化

海参在4 ℃处理下的可溶性胶原蛋白含量变化如图2所示。可溶性胶原蛋白含量在前5 d 变化不显著，与图1海参形态的结果相符，海参在前期体壁保留完好，胶原蛋白未发生明显水解。随处理时间的延长，海参的可溶性胶原蛋白含量增加显著（P＜0.05），之后呈不断上升趋势，表明海参胶原蛋白在不断水解。处理60 d 时，可溶性胶原蛋白含量已经达到（19.42 ± 0.82）mg/g，是对照组含量的5.53 倍。这与Zhu 等[8]研究鲍鱼肌肉的可溶性胶原蛋白含量变化趋势具有一定的相似性。可溶性胶原蛋白是胶原蛋白的一部分，是肌肉组织经加热或酶解后分解并溶于水的胶原[9]。

图2 海参在4 ℃贮藏条件下可溶性胶原蛋白含量的变化Fig.2 Soluble collagen content change of sea cucumber at 4 ℃storage conditions

2.3 质构的变化

海参自身的酶解和微生物作用使其变得更加柔软，弹性下降。海参的硬度、弹性、凝聚性、咀嚼性等与时间呈负相关。海参在4 ℃处理下的硬度及其咀嚼性变化如图3所示。前5 d，海参的硬度变化不显著；15～25 d 时，硬度下降显著（P＜0.05）；25 d 时，硬度已经降到（3 301.7±253.1）g，比对照组的硬度下降约9 倍多，比较海参在4 ℃处理条件下的形态变化（图1）发现处理25 d 时的海参损伤较为严重，表明低温处理时间过长对海参造成了负面影响。2015年，Lu 等[10]发现在4 ℃低温条件下处理后的鱼片硬度呈先增大后下降的趋势，与本试验结果呈相似的趋势。海参在4 ℃条件下的咀嚼性变化与硬度变化趋势略有不同，在处理15 d 之前，咀嚼性的变化均不显著，之后随着处理时间的延长，咀嚼性在15～25 d 时，与处理初期相比，明显下降（P＜0.05），25 d 时，咀嚼性下降至（516.7±160.8）g，为未处理海参咀嚼性的4.6%，硬度和咀嚼性均在处理1 d 时出现最高值，而与未处理海参比均不显著，总体呈先增大后减小的变化趋势。此结果表明硬度和咀嚼性不是随处理时间的延长而逐渐下降，存在变硬过程，而后逐渐下降。

2.4 蛋白质的降解情况

海参在4 ℃处理条件下的蛋白变化如图4所示。前10 d 蛋白质变化不明显，处理15 d 时，200 ku 蛋白条带下面颜色加深，表明大分子蛋白开始出现降解，30 d 和60 d 时肌动蛋白条带完全消失，其它蛋白条带与对照组相比减少很多，表明在低温处理30 d 后，海参体壁组织结构几乎完全丧失，蛋白质发生了明显降解。这与Christensen等[11]发现鲱鱼和Thavaroj 等[12]研究发现的鲶鱼和罗非鱼经长时间低温处理后，其肌动蛋白会发生降解的结果相符。因此，海参长时间低温处理会引起蛋白质降解。

2.5 组织蛋白酶-L 活力的变化

海参在4 ℃贮藏条件下的酶活力变化如图5所示。整个处理期间，酶活力变化呈先升高到最大值后逐渐下降的趋势；处理15 d 时，组织蛋白酶-L 的酶活力虽有升高，但基本保持在较稳定的水平；处理20 d 时，组织蛋白酶-L 活力达到最大值（3 170.5±244.3） U/mg 蛋白（P＜0.05）；随后组织蛋白酶-L 活力开始下降，贮藏30 d 时降低至原来水平。2014年，Ge 等[13]报道组织蛋白酶-L 会间接影响蛋白降解。而本研究中组织蛋白酶-L没被激活前，从图4中未观察到蛋白降解，这也验证了组织蛋白酶-L 与蛋白降解有关。

图3 海参在4 ℃贮藏条件下质构的变化Fig.3 Changes in texture of sea cucumber at 4 ℃storage conditions

2.6 Caspase-3 活力的变化

海参在4 ℃处理下的Caspase-3 活力变化如图6所示。前期Caspase-3 未被激活，处理5 d仍保持较低活力；随低温处理时间的延长，酶活力开始升高，到25 d 时Caspase-3 的相对活力达到初始酶活力的2.53 倍（P＜0.05），之后酶活力显著下降，而Caspase-3 的酶活力变化与内源酶中的组织蛋白酶-L 有一定的关联性，从而导致蛋白质降解。

图4 海参在4 ℃贮藏条件下的SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE pattern of sea cucumber at 4 ℃storage conditions

图5 海参在4 ℃贮藏条件下组织蛋白酶-L 活力变化Fig.5 Changes in the activity of cathepsin-L of sea cucumber at 4 ℃storage conditions

图6 海参在4 ℃贮藏条件下caspase-3 活力变化Fig.6 Changes in the activity of caspase-3 of sea cucumber at 4 ℃storage conditions

2.7 β-actin 表达量的变化

海参在4 ℃处理下的β-actin 蛋白表达量的情况如图7所示。β-actin 蛋白信号随时间延长呈逐渐降低的趋势，且在30～60 d 消失，与图4的电泳结果相符，同样表明蛋白质发生了明显降解。

2.8 ROS 生成量的变化

海参在4 ℃处理下的自由基生成情况如图8所示。ROS 信号强度随时间的延长，呈先上升后下降的趋势，于20 d 时达到最大值（1.08×105），约是对照组自由基生成量的2.3 倍（P＜0.05）。ROS 可修饰蛋白质骨架肽链和氨基酸侧链，以改变蛋白的交联或降解，决定产品的风味、质构、颜色及蛋白质的组成，使正常蛋白质活性增强或减弱[14]。从上述结果可以看出，低温处理过程中，氧自由基显著提高，发生了氧化应激反应，而当ROS 的生成量增加到一定程度时，会对机体产生较大影响，使产品品质发生改变。

图7 海参在4 ℃贮藏条件下蛋白表达量的情况Fig.7 Protein expression in sea cucumber at 4 ℃storage conditions

3 结论

随着低温处理时间的延长，海参质构和理化性质发生改变，其中包括形态变化，质构变化（咀嚼度和硬度），内源酶活化，胶原溶出，蛋白降解。海参经低温处理后，将会产生ROS 并大量积累，使内源酶被激活，如Cathepsin-L 及Caspase-3，内源酶活力的升高使得后期蛋白质发生降解以及胶原溶出，最终使海参质构和形态发生改变。

图8 海参在4 ℃贮藏下自由基生成情况Fig.8 Free radical production in sea cucumber at 4 ℃storage conditions