刘明辉 黄 波 冯瑶 刘晓舒 王 实 张 何 宋光熠 刘文艳*
辽宁医药职业学院,辽宁 沈阳 110101
糖尿病肾病是糖尿病常见的慢性并发症,其发生发展是由多种因素的综合作用而导致,因其病因复杂而使得临床治疗缺乏有效的药物,目前在糖尿病及其并发症的防治的药物应用上,中药及其有效组分被广泛关注。本实验研究旨在证实复方中药组分对糖尿病及糖尿病肾病防治的有效性,并对其作用机制进行研究探讨。
1.1材料 SPF级SD种系大鼠(8周龄、190~210g体重)、繁育鼠固体颗粒饲料(由辽宁省长生生物技术有限公司提供)。链脲菌素(Streptozotocin)为Adamas Reagent CO.Ltd产品(货号:CFHF-33231A批号:644548120509规格:25g;95+)。中药复方制剂(成分含黄芪多糖、麦冬多糖、三七皂苷等)由北京普惠天悦生物技术有限公司提供。caspase-3、Na+,K+-ATPase、SOD、CAT、MDA等测定试剂盒均来源于南京建成生物工程研究所。实验设备有北京京立LDZ5-2低速离心机、德国耶拿SPECORD plus200紫外-可见分光光度计、上海三科318C酶标仪。
1.2方法
1.2.1制作大鼠糖尿病模型方法 用0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH5.0)配制浓度为12.2mg/ml的链尿菌素,每1Kg体重以155mg的标准一次性大鼠腹腔注射给药。链尿菌素注射给药1周后,检测大鼠空腹血糖,将其中血糖水平高于16.0mmol/L的大鼠选为合格大鼠,随机将合格大鼠分为模型对照组、中药组分干预组(小剂量干预组、大剂量干预组),要求10只/组、雌雄各半。
1.2.2实验方法 小剂量干预组、大剂量干预组大鼠分别以50mg/Kg、500mg/Kg(体重)标准,每天用复方中药组分灌胃;模型对照组大鼠每天用同样体积生理盐水灌胃。灌胃药量标准各组均为10ml/kg(体重)。另取10只大鼠(雌雄各半)作为正常(空白)对照组,用与注射链尿菌素同样体积的0.01mol/L、 pH5.0柠檬酸缓冲液,给大鼠一次性腹腔注射,并每天以10ml/kg(体重)标准的生理盐水灌胃。各组大鼠连续给药12周后,进行以下实验检测:①断头采血进行caspase-3检测。②肾脏取材,进行10%组织匀浆后,再离心15min(3000r/min),最后取上清液进行Na+,K+-ATPase、SOD、CAT和MDA检测(按试剂盒说明书操作)。
2.1 Caspase-3含量、肾组织Na+,K+-ATPase活性的变化 连续给药12周后,各组大鼠实验检测结果提示:链脲菌素糖尿病模型对照组Caspase-3含量明显高于空白对照组、肾组织Na+,K+-ATPase活性明显低于空白对照组;大剂量组肾组织Na+,K+-ATPase活性明显高于模型对照组;复方中药组分无论是大剂量组还是小剂量组,其Caspase-3含量均明显低于模型对照组;小剂量组与模型对照组无显著性差异。详见表1
表1 中药组分对链脲菌素糖尿病大鼠血浆Caspase-3和肾组织Na+,K+-ATPase的影响的影响
2.2肾组织SOD、CAT、MDA的变化连续给药12周后,各组大鼠血浆SOD、CAT、MDA的检测结果为:糖尿病模型对照组MDA明显高于正常对照组,而其SOD和CAT明显低于空白对照组;复方中药组分大剂量组SOD和CAT均高于模型对照组,但其MDA则低于模型对照组;复方中药组分小剂量组SOD、CAT和MDA与模型对照组比较均无显著性差异。详见表2
表2 中药组分对链脲菌素糖尿病大鼠肾组织SOD、CAT、MDA的影响
糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)作为糖尿病常见的慢性并发症,是导致糖尿病患者死亡的主要原因。糖尿病持续10~20年,DN的发生率能达到30%~50%,出现蛋白尿的患者临床观察约7年内有50%发展至终末期肾病(End-stage renal disease,ESRD),所以,DN早期的防治尤为重要[1,2]。大量的研究表明在DN蛋白尿发生、发展和肾小球硬化过程中,肾脏细胞损伤是直接致病因素。
Caspase-3是氧化应激引起肾脏细胞凋亡损伤的重要细胞因子[3,4]。生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质能够被SOD消除,SOD可对抗与阻断因氧自由基而造成的细胞损害,还可及时修复受损细胞,是氧自由基的头号杀手[5];CAT主要作用就是催化过氧化氢分解成氧和水,达到清除体内的过氧化氢的目的,使得H2O2不能与O2反应生成非常有害的-OH,从而使细胞免于遭受H2O2的毒害[5,6];自由基作用于脂质发生过氧化反应的终产物即MDA,具有细胞毒性,其产生也会加剧膜的损伤。
本项实验研究表明由含黄芪多糖、麦冬多糖、三七皂苷等中药成分配制的复方制剂对链脲菌素糖尿病大鼠的肾脏具有保护作用,其作用机制与下调caspse-3水平,抑制肾脏细胞凋亡和脂质过氧化反应,升高SOD、CAT,降低MDA及提高肾脏组织Na+,K+-ATPase活性均密切相关,但要发挥这些作用,要求复方制剂需要大剂量使用,如小剂量应用则对肾脏几乎无保护作用。