HBV感染者外周血microRNA和AFP水平与肝纤维化、HBV-DNA的相关性*

彭思璐 刘 冰 寇 丹 刘仁伟

四川绵阳四0四医院感染科，四川 绵阳 621000

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在我国癌症死因顺位中，肝癌仅次于肺癌，位居第二，已成为严重威胁我国居民健康的重要疾病之一。近来的研究[1]结果提示，肝癌及其癌前病变过程与肝细胞内的癌基因激活、抑癌基因失活及相关基因调控通路紊乱有关，microRNA(miR)是一类长度约为18-25个核苷酸的非编码单链 RNA分子，均由内源基因编码，虽然不能参与蛋白质的合成，但对于基因功能和表达水平可发挥着重要的调控作用，在多种肿瘤的发生和发展过程中均扮演着重要的角色。但采用miR作为肝癌风险预警标志物的相关研究仍不够充分，特别是与AFP等传统血清标志物用于评价肝纤维化程度、病毒载量等的对比研究较为缺乏。基于上述现况，本文针对HBV感染者外周血miR和AFP水平与肝纤维化、HBV-DNA的相关性进行了分析，现报告如下：

1 资料与方法

1.1研究对象

选取2018年02月-2020年02月在四川绵阳四0四医院感染科就诊的33例HBV感染患者作为研究对象，对患者外周血miR水平、AFP水平进行检测，并分析其与肝纤维化程度、血清HBV-DNA水平、血清HBV五项指标的相关性，所有患者均签署知情同意书自愿参与本研究，本研究方案符合《赫尔辛基宣言》要求。纳入标准：入选患者均符合中华医学会感染病学分会、中华医学会肝病学分会制定的《慢性乙型肝炎防治指南》中慢性HBV感染诊断标准[2]，诊断标准为：既往有CHB病史或乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性超过6个月，现HBsAg和(或)HBV-DNA仍为阳性，年龄大于18岁，临床资料完整。排除标准：合并其他肝炎病毒感染者、酒精性肝病患者、免疫性肝病患者、代谢或遗传性肝病患者、肝癌患者；合并其它部位恶性肿瘤、血液疾病、免疫缺陷症、心肺肾等其它重要器官功能不全患者、脑卒中、急性冠状动脉综合征的患者；妊娠期或哺乳期患者。

1.2观察指标和检测方法

1.2.1无创肝纤维化检测 采用Fibrotouch瞬时弹性成像技术对患者的肝硬度值(LSM)进行定量检测，瞬时弹性扫描仪购自法国Echosens公司，根据《瞬时弹性成像技术(TE)临床应用专家共识(2015年)》[3]，将LSM>8.5kPa判定为显著肝纤维化，并将纳入患者分为研究组(发生显著肝纤维化)和对照组(未发生显著肝纤维化)。

1.2.2血浆miR水平检测 采集所有患者的空腹外周静脉血样本5mL，取2mL血样经乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝处理后离心分离血浆，采用R1200-100T型总RNA提取试剂盒(美国Solarbio公司)提取血浆总RNA，采用特异的茎环引物对目标microRNA进行混合反转录，采用TaqMan实时荧光定量聚合酶链氏反应(PCR)方法对miR-20a、miR-21、miR-26a、miR-122、miR-192、miR-146a、miR-223和miR-483-5p等8种miR水平进行检测，PCR扩增仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司，引物购自博奥新景公司。

1.2.3血清AFP水平检测 取3mL血样在室温下静置2h后离心分离血清，应用UniCel DxI800型全自动免疫分析系统(美国Beckman Coulter公司)采用化学发光免疫法对血清AFP水平进行检测，试剂盒为仪器配套试剂盒。

1.2.4血清HBV-DNA水平检测 采用实时荧光PCR方法对血清HBV-DNA水平进行定量检测，试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2.5血清HBV五项检测 采用化学发光法对血清HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb进行定量检测，化学发光分析仪及试剂盒均购自美国雅培公司。

2 结 果

2.1两组患者年龄、性别构成及观察指标的比较 两组患者在年龄、性别构成及血清HBV五项指标、AFP水平方面的差异无统计学意义(P>0.05)，研究组患者的LSM、血浆miR水平、血浆HBV-DNA水平分布均高于对照组，两组之间的差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组患者年龄、性别构成及观察指标的比较

2.2HBV感染者外周血miR和AFP水平与肝纤维化、HBV DNA的相关性分析 Spearman等级相关分析结果显示，血浆miR水平与LSM、血清HBV-DNA水平均呈正相关关系(P<0.05)，与年龄、血清HBV五项指标、血清AFP水平均无相关性(P>0.05)，而血清AFP水平与年龄、血浆miR水平、LSM、血清HBV-DNA水平、血清HBV五项指标均无相关性(P>0.05)。见表2

表2 HBV感染者外周血miR和AFP水平与肝纤维化、HBV-DNA的相关性

3 讨 论

肝癌具有起病隐匿，早期诊断率低及高侵袭性、高转移率、高复发率的临床特点，故早期预警、早期诊断是改善肝癌预后的关键。目前，针对肝癌及其癌前病变的诊断方法主要包括病理学检查、影像学检查及实验室检查，其中，肝穿刺活组织检查是诊断金标准，但针对早期病灶的穿刺难度较大，而且作为一种创伤性检查，无法用于筛查和监测；超声、计算机断层扫描(CT)、核磁共振成像(MRI)等影像学检查对于早期肝癌的诊断具有较大局限性，难以检出体积小的病灶，而且有超过20%的早期肝癌缺乏典型的影像学表现[4]；血液肿瘤标志物检测具有操作简便、无创、可动态监测等优势，能够用于无症状人群的肿瘤筛查，成为了肝癌预警及其癌前病变诊断的重要手段和热点研究领域。miR一般由RNA聚合酶II转录产生，成熟的miR与目标mRNA的3'-UTR区互补配对，通过降解靶mRNA、抑制靶mRNA转录后翻译等机制调节靶蛋白的生成，从而发挥维持正常干细胞功能、调控细胞增殖分化等多重生物学作用。miR基因表达量约占整个基因组的1%，目前在人类基因组内发现的miR种类已经超过2500个，可对人类基因组中三分之一的基因发挥调节作用。近年来，有研究[5]利用miR探针基因芯片技术发现了miR-221、miR-145、let-7及 miR-122a等35种miR在原发性肝癌和肝硬化组织中存在表达异常，在后续的研究[6]中，学者们又先后发现了miR-125b、miR-195、miR-199a、miR-101、miR-718等多种与肝癌的发生、发展、复发、转移等生物学特征有关的miR，由于miR片段较小且具有稳定性，故外周血miR表达水平与肿瘤组织中表达水平具有相似的变化趋势，血浆miR不受RNA酶的影响，能够在低温条件下长期保存且检测方便，可实现检测技术的标准化，这都提示了miR有望成为一种新型血液标志物用于肝癌的预警和早期诊断。近年来，研究者发现，肝癌患者外周血中存在多种miR的异常表达，这些miR可能来源于肿瘤组织细胞内部，当肿瘤细胞坏死或凋亡时，这些miR通过外泌体等方式进入血液循环，此外，在肿瘤侵袭周围组织过程中，正常组织中的miR也会因组织损伤而释放入血。本研究结果显示，出现显著肝纤维化的HBV感染患者的血浆miR水平出现了明显上调，而且其水平与LSM及血清HBV-DNA水平具有相关性，能够用于预测HBV感染患者的显著肝纤维化。通过这一结果可见，外周血miR表达水平的升高可能提示着肝纤维化程度的加剧和病毒活动性的增强，提示着肝癌发生风险的升高，其机制可能是，在HBV感染病变进展至肝纤维化时期时，肝组织细胞的破坏和不良增生会导致细胞内的特异性miR释放入血，从而使患者出现外周血miR水平的上升，因此，血浆miR水平可作为评价HBV感染患者病情活动度和肝癌风险的辅助指标。同时，本研究结果也提示了HBV-DNA水平对于预测肝纤维化也具有一定的价值，这提示了较高的病毒载量可能与肝纤维化程度有关，故及时有效的抗病毒治疗也是降低HBV感染患者肝癌风险的关键手段。

综上所述，HBV感染患者血浆miR水平与其肝纤维化程度和病毒载量具有相关性，而AFP与这两项指标缺乏相关性，血浆miR水平和血清HBV-DNA水平可作为预测患者肝纤维化的辅助指标，肝纤维化程度高和HBV-DNA载量水平高的人群发生肝癌风险程度高，临床医生应有效利用miR等外周血标志物对患者的肝癌风险开展早期预警，积极采取抗病毒和抗肝纤维化治疗，从而降低肝癌发病风险、提高早期诊断率、改善患者的预后。