Foxp3+调节性T 细胞及程序性死亡受体1在胃癌组织中的表达及其临床病理意义

鞠晓静

（天津市武清区中医医院病理科，天津 301700）

胃癌（gastric cancer）是常见的消化系统恶性肿瘤，好发于50 岁以上人群，男性发病率约为女性的2 倍[1]。Hp 感染、饮食习惯不规律是引起胃粘膜上皮恶性病变的主要原因。同时，一些慢性上消化道疾病随着疾病的进展患者也可能出现胃粘膜上皮恶性病变，引发胃癌。胃癌的发病较为隐匿，患者早期通常无明显症状，随着疾病的进展患者可能出现上腹痛的疼痛、食欲减退、消瘦、呕血黑便等症状，多数患者在就诊时已处于胃癌的进展期。疾病进展至晚期患者会出现锁骨上淋巴结肿大、腹水等症状，胃癌的恶性程度高，若未及时诊治，患者的预后较差。有研究显示[2]，胃癌患者外周血及肿瘤局部组织中Foxp3+调节性T 细胞（Foxp3+Tregs）比例明显升高。Foxp3+Tregs 主要介导肿瘤的免疫逃逸，其值升高会抑制肿瘤的免疫反应加速肿瘤的生长，严重影响患者的生存质量[3]。程序性死亡受体1（PD1）主要通过与配体相互作用使得活化的T 细胞凋亡发挥负向免疫调控作用[4]。PD1 与Foxp3+Tregs 的功能维持与产生存在相关性，其在多种肿瘤中高表达，影响患者预后。为此，本文主要就PD1 与Foxp3+Tregs 在胃癌组织中的表达情况进行研究，分析PD1 与Foxp3+Tregs 表达情况与患者临床病理、预后的关系及两者之间是否存在相关性，为临床选择抗肿瘤免疫治疗策略提供些许参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011 年1 月～2016 年12 月天津市武清区中医医院收治的121 例胃癌患者，取其胃癌组织及癌旁正常组织作为新鲜标本。纳入患者均经病史、临床特征、胃镜检查及组织病理学检查确诊为胃癌；胃癌的病理类型均为胃腺癌；均未接受过任何抗癌治疗。121 例胃癌患者男女性别比为81∶40。年龄以60 岁为分界线，其中＜60 岁68 例，≥60 岁53 例；肿瘤大小以5 cm 为分界线，其中＜5 cm 63例，＞5 cm 58 例；根据胃癌的分化程度将其分为高分化型腺癌、中分化型腺癌及低分化型腺癌，分别为20 例、36 例、65 例。根据胃癌病变位置的不同将其分为胃底癌、胃体癌及胃窦癌，分别为23 例、29 例、69 例。38 例无淋巴结转移，83 例发生淋巴结转移。TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期49 例，Ⅲ、Ⅳ期72 例。

1.2 试剂 Foxp3 兔抗人多克隆抗体、PD1 兔抗人多克隆抗体均购自福建迈新生物技术开发有限公司，通用二氨基联苯胺（DBA）显色剂试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组化染色方法 常规手术切除患者胃癌组织及癌旁正常组织作为新鲜标本，用10%的中性福尔马林进行标本固定，石蜡包埋后连续切片，厚度为4 μm，采用免疫组化（SP）方法检测Foxp3+Tregs 和PD1 的表达水平。将石蜡切片放置于68 ℃的烤箱中烤干20 min，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，3%H2O237 ℃孵育10 min，磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗3 次，5 min/次（以下方法部分PBS 冲洗时间及次数同）；抗原修复：置于95 ℃、pH=6 的枸橼酸缓冲液中热修复，采用冷水冲洗，自然冷却20 min 后加速冷却至室温，PBS 冲洗，正常羊血清工作液封闭，放置于4 ℃冰箱中滴加一抗孵育过夜，PBS 冲洗后滴加二抗，PBS 冲洗；滴加链霉素卵白素工作液（过氧化物酶标记），PBS 冲洗；清水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，干燥，封片。

1.4 免疫组化结果的判定标准 细胞膜、胞浆和（或）胞核出现黄色至棕褐色染色为阳性显色，胞核阳性提示Foxp3 在肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中表达，胞膜或胞浆阳性提示PD1 在TILs 中表达。每张切片在高倍显微镜下选择5～8 个视野进行观察，根据染色强度及阳性细胞占比进行判定。染色强度：（-）为无着色、（+）为浅黄色、（++）为棕黄色、（+++）为棕褐色，分别以0、1、2、3 分计。阳性细胞占比：（-）、（+）、（++）、（+++）分别代表无阳性细胞、阳性细胞≤25%、阳性细胞占26%～50%、阳性细胞＞50%，以0、1、2、3 分计。两项的分数相加0 分为阴性（-）、1～2分为弱阳性（±），3～4 分为阳性（++），5～6 分为强阳性（+++）。切片结果由2 名经验丰富的病理科医生判定。

1.5 统计学处理 采用SPSS 21.0 统计学软件对本研究的数据进行处理分析，其中符合正态分布的计量资料用（±s）表示，比较采用t检验；计数资料用[n（%）]表示，比较采用χ2检验，采用Pearson 相关性分析Foxp3+Tregs 和PD1 的相关性，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Foxp3+Tregs 和PD1 在胃癌组织及癌旁正常组织中的阳性表达率比较 Foxp3+Tregs 和PD1 在胃癌组织中的阳性表达率高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 胃癌组织中Foxp3+Tregs 和PD1 表达情况与胃癌临床病理的关系 不同性别、年龄、肿瘤大小及病变位置胃癌组织中Foxp3+Tregs 和PD1 的表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；不同肿瘤分化程度、TNM 分期及淋巴结转移胃癌组织中Foxp3+Tregs 和PD1 的表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 胃癌组织Foxp3+Tregs 和PD1 表达情况与胃癌临床病理的关系（n）

表2 （续）

2.3 胃癌组织中Foxp3+Tregs 和PD1 的相关性 胃癌组织中Foxp3+Tregs 与PD1 的表达呈正相关，见表3。

表3 胃癌组织中Foxp3+Tregs 和PD1 表达的相关性

2.4 Foxp3+Tregs、PD1 阳性与阴性患者生存情况比较 Foxp3+Tregs 阳性患者的生存率为21.33%（16/75），阴性患者的生存率为73.91%（34/46），差异有统计学意义（P＜0.05）；PD1 阳性患者的生存率为26.92%（21/78），阴性患者的生存率为62.79%（27/43），差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

胃癌是发生于胃粘膜上皮的恶性肿瘤，其发病机制尚未完全明确，可能与多种因素综合作用导致的胃粘膜上皮恶性病变有关[5]。临床诊断胃癌较常采用胃镜检查。手术切除、放化疗和靶向治疗是治疗胃癌的主要方式[6-8]。胃癌的临床症状缺乏特异性，疾病初期患者无明显症状，偶尔表现为上腹部不适、饭后腹胀等症状，易误诊为上消化道溃疡，延误最佳的治疗时机。多数患者在就诊时已处于疾病的进展期，若未及时治疗易引起胃出血、幽门或贲门梗阻、胃穿孔等并发症[9]。胃癌进展至晚期会出现扩散和转移，严重威胁患者生命，给患者及家庭带来巨大的心理及经济负担，因此，在诊治的同时，及时评估患者的预后情况对于改善生存率也具有一定的临床价值。

Foxp3+Tregs 作为T 细胞亚群，其具有独特的免疫调节功能，可维持机体免疫耐受、同时在抑制免疫反应中也起着重要作用，其中的Foxp3 是Tregs 分化、发育、功能维持的决定性因子[10，11]。研究显示[12，13]，Foxp3+Tregs 数量及比例在肿瘤患者外周血及肿瘤局部组织中明显升高，其升高可导致患者自身免疫效应T 细胞对肿瘤产生免疫耐受，加速肿瘤的发生发展，对患者预后造成严重影响。PD1 是CD28 免疫球蛋白超家族中的一种免疫抑制分子，分子量为50～55 Kd，其可被诱导表达于多种免疫细胞（如T细胞、B 细胞、单核细胞和树突状细胞等），主要表达于T 细胞，可负向调节T 细胞的增殖，抑制T 细胞的免疫功能。阻断PDI 信号通路可逆转T 细胞功能失调，增强肿瘤特异性T 细胞反应，发挥抗肿瘤免疫治疗作用。

本研究通过测定121 例胃癌患者胃癌组织及癌旁正常组织中Foxp3+Tregs 和PD1 的表达情况，发现胃癌组织Foxp3+Tregs 和PD1 阳性表达率高于癌旁正常组织，可能与胃癌组织抑制T 细胞对外源及自体抗原的免疫反应有关。进一步分析Foxp3+Tregs和PD1 在胃癌组织中的表达情况及与临床病理的关系，发现不同肿瘤分化程度、TNM 分期及淋巴结转移胃癌组织中Foxp3+Tregs 和PD1 的表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05），分析其原因可能为患者发生淋巴转移、TNM 分期及分化程度越高，肿瘤细胞的生长速度越快，导致细胞质内缺氧严重，PD1阳性表达升高，抑制T 细胞的免疫功能，影响患者的预后。癌症病情越严重，Foxp3+Tregs 和PD1 的阳性表达率越高。本研究随访3 年发现，Foxp3+Tregs与PD1 阴性表达患者生存情况优于阳性表达患者，表明Foxp3+Tregs 与PD1 异常表达对患者的生存及预后有很大的影响。同时，本研究结果显示，Foxp3+Tregs 与PD1 呈正相关，PD1 可诱导Foxp3，使肿瘤特异性T 细胞转为Tregs，增强免疫耐受。

综上所述，Foxp3+Tregs 与PD1 可作为判断患者病情进展及预后的生物学标志，肿瘤分化程度、TNM 分期及淋巴结是否转移均会影响其表达情况，Foxp3+Tregs 与PD1 阳性表达会影响患者的生存情况。