马氏珠母贝肠道及其养殖水体可培养细菌群落结构

陈 琨，黄 湾，廖永山，杨创业,3，王庆恒,3

（1.广东海洋大学水产学院// 2.广东海洋大学珍珠研究所// 3.广东省海水养殖生物育种工程实验室,广东 湛江 524088）

肠道微生物是动物体内最重要微生物群落[1-2]，在宿主生长发育、消化吸收和免疫等生理活动中不可或缺[3-5]。近年来，以16S rRNA 基因序列分析为基础的变性梯度凝胶电泳技术和高通量测序技术广泛应用于肠道菌群研究[6-8]。肠道菌群分泌的代谢产物中含多种酶，能参与多糖、氨基酸和外源性化学物质的代谢，促进宿主对营养物质的消化吸收[9]。肠道菌群能刺激肠道上皮细胞增殖，增强宿主的先天免疫应答[10]。此外，肠道菌群失调会导致宿主发育减慢和免疫功能紊乱[11]。研究表明，水产动物肠道菌群结构的动态平衡受自身生理状态、饲料和水体环境等诸多因素影响[12-15]。养殖水体中含有大量微生物，消耗水体中的有机物，促进物质循环。王贤丰等[16]研究发现，水产动物肠道菌群与其养殖环境菌群密切相关。当环境恶化时，环境菌群生态平衡失调，病原菌就会大量繁殖，从而暴发细菌性疾病[17-18]。目前，关于水产动物肠道及其养殖环境菌群结构的研究主要集中于大菱鲆（Scophthalmus maximus）[19]、拟穴青蟹（Scylla paramamosain）[16]、刺参（Stichopus japonicus）[20]等。

马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii），隶属于软体动物门、双壳纲、珍珠贝目、珍珠贝科，在中国主要分布于广东、广西和海南三省沿海地区[21]，是主要海水育珠贝，具有很高经济价值。但随着养殖密度和养殖规模扩大，马氏珠母贝的病害发生日益严重，同时自然灾害、环境污染、养殖容量等问题也给马氏珠母贝养殖造成不利影响。因此，分析马氏珠母贝肠道及其养殖水体菌群结构对马氏珠母贝健康养殖具有重要意义。本实验室已利用高通量测序技术分析了不同蛋白源饲料对马氏珠母贝肠道菌群结构的影响[22]，而关于马氏珠母贝肠道菌可培养细菌未见报道。

本研究分析海区养殖马氏珠母贝肠道菌群与养殖水体菌群种类及丰度，以期为认识马氏珠母贝肠道菌群结构、益生菌筛选和病害防治，构建马氏珠母贝生态健康养殖技术提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

马氏珠母贝为2 龄贝，壳长（62.3±6.1）mm，取自广东雷州覃斗镇后洪村养殖区，清洗表面附着物，同时采集养殖海区水样放置于无菌采水瓶。所采集的样品于冰盒中运送至实验室。

1.2 方法

1.2.1 样品处理 用体积分数75%乙醇擦拭马氏珠母贝体表，在超净工作台剖取肠道，无菌海水冲洗3 次后置于灭菌离心管中，加入1 mL 无菌海水作为匀浆液，用频率为24 Hz 组织匀浆机对肠道样品匀浆2 min，重复匀浆1 次，将匀浆液稀释100倍后，取100 μL 涂布于2216 E 固体培养基上，28 ℃恒温恒湿培养7 d 并统计菌落数，根据活菌计数法计算样品可培养细菌的数量。同时在每个梯度的平板上各随机挑取50 个菌落，在2216E 固体培养基上划线纯化，将纯化后菌株保存于2216E 斜面备用。

养殖海区水样在无菌环境中稀释10 倍，取100 μL涂布于2216E固体培养基上，后续步骤同上。

1.2.2 细菌DNA的提取、PCR扩增及序列测定 水浴法提取细菌DNA：用无菌牙签蘸取少量划线纯化的单个菌落，混于装有20 μL 灭菌ddH2O 的离心管中，置于沸水中水浴2 min 后，迅速置于冰上，使细胞裂解，释放出DNA，-20 ℃保存备用。对于水浴法扩增不出的菌株采用细菌基因组试剂盒（OMEGA）提取，详细步骤参照说明书进行。以所提取的细菌DNA 作为模板，细菌通用引物[27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)]为扩增引物，扩增细菌16S rRNA 基因片段。PCR 反应体系：基因组DNA 模板 (10～100 ng/μL) 0.5 μL，引物27F (20 pmol/L) 0.5 μL，引物1492R (20 pmol/L) 0.5 μL，10×PCR buffer 5.0 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 1 μL，rTaq DNA 聚合酶 (Takara 10 U/μL) 0.2 μL，补充ddH2O至50 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；55 ℃30 s；72 ℃ 90 s，33～ 35 个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃下保存。利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物是否符合目标条带，PCR 产物的测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3 序列注释

利用在线公共数据库 EzBiCloud（http://www.ezbiocloud.net/eztaxon）进行各菌株序列的同源性比对，从比对结果中选取相似性最高的序列进行注释。

2 结果与分析

2.1 可培养细菌计数

马氏珠母贝肠道匀浆液可培养细菌数量为1.72×105CFU·mL-1，其所在养殖水体中可培养细菌计数量为2.15×104CFU·mL-1，可见马氏珠母贝肠道可培养细菌数量多于养殖海区水体可培养细菌。

2.2 各样品细菌群落组成

从肠道和养殖水体获得各150 个纯化菌株，经16S rRNA 基因扩增和序列比对后表明，本次检测中获得所有菌株与数据库中相关菌株的16S rRNA基因序列相似性为99%，归属于2 个门、3 个纲、7个目、10 个科、23 个属、56 个种，肠道和水体样品在不同分类水平上菌群组成存在较大差异（表1），肠道样品在分类水平上所包含的种类少于养殖水体样品。

表1 马氏珠母贝肠道和养殖水体菌群基本构成Table 1 Composition of bacterial communities in different samples

2.3 门和纲水平的细菌组成结构分析

如表2 所示，马氏珠母贝肠道样品150 株细菌归属于2 门2 纲，即变形菌门Proteobacteria 的γ-变形菌纲 Gammaproteobacteria 和厚壁菌门Firmicute 的芽孢杆菌纲Bacilli。其中，变形菌门和γ-变形菌纲分别为优势门和优势纲，均占菌株总数的97.3%。

表2 马氏珠母贝肠道和水体中菌群的组成比例（纲水平）Table 2 Proportion of microflora in the tract of Pinctada fucata martensii and the water (at class level)

养殖水体样品150 株细菌同样归属于变形菌门和厚壁菌门，两者分别占菌株总数的91.3%和8.7%。与肠道菌群不同，水体样品中变形菌门细菌由α-变形菌纲Alphaproteobacteria 和γ-变形菌纲组成，且前者为优势群体，占菌株总数的69.3%。γ-变形菌纲和厚壁菌门的芽孢杆菌纲分别占22.0%和8.7%。

2.4 目和科水平的细菌组成结构分析

如图1 所示，在目水平上，本研究获得的马氏珠母贝肠道可培养细菌分属 4 目，即弧菌目Vibrionales、海洋螺菌目Oceanospirillales、交替单胞菌目Alteromonadales 和芽孢杆菌目Bacillales。其中，弧菌目为优势群体，占菌株总数的76.0%，其次为交替单胞菌目，为20.7%。

图1 马氏珠母贝肠道及其养殖水体培养细菌群落组成（目水平）Fig.1 Culturable bacterial community compositions in Pinctada fucata martensii and water (at order level)

在目的水平上，养殖水体中可培养细菌的生物多样性明显优于肠道菌群，分属于7 个目，分别为红细菌目Rhodobacterales、弧菌目、芽孢杆菌目、海洋螺菌目、根瘤菌目Rhizobiales、交替单胞菌目和假单胞菌目Pseudomonadales。优势群体与肠道菌群也有明显差异，数量最多的是红细菌目，占菌株总数的68.0%，其次才是弧菌目，为18.0%。

如图2，在科水平上，马氏珠母贝肠道可培养细菌分属5 科，即弧菌科Vibrionaceae、假交替单胞菌科 Pseudoalteromonadaceae、希瓦氏菌科Shewanellaceae、盐单胞菌科Halomonadaceae 和芽孢杆菌科Bacillaceae。其中，弧菌科为优势菌科，占菌株总数的76.0%，其次为假交替单胞菌科，为18.7%。

图2 马氏珠母贝肠道及其养殖水体可培养细菌群落组成（科水平）Fig.2 Culturable bacterial community compositions in Pinctada fucata martensii and water (at family level)

养殖水体中可培养细菌的科数量多于肠道样品，共有 9 个科，主要菌科为红杆菌科Rhodobacteraceae（68.0%）、弧菌科Vibrionaceae（18.0%）、芽孢杆菌科Bacillaceae（8.7%），优势菌科与肠道样品菌群也存在明显差异。

2.5 属水平的细菌组成结构分析

本研究从马氏珠母贝肠道和养殖水体分离的可培养细菌分属23 属。其中，4 个属为二者共有；2 个属为马氏珠母贝肠道特有菌；17 个属仅从养殖水体中分离获得（表3）。

表3 马氏珠母贝肠道及其养殖水体共有、特有细菌的群落组成（属水平）Table 3 Culturable bacterial community in Pinctada fucata martensii and water (in genes)

在数量组成上，二者有明显差异。其中，马氏珠母贝肠道菌群的优势属分别为弧菌属Vibrio（74.7%）、假交替单胞菌属Pseudoalteromonas（18.7%）、芽孢杆菌属Bacillus（2.7%）和希瓦氏菌属Shewanella（2.0%）；养殖水体的菌群的优势属分别为α-变形菌纲的FJ943236_g属（40.7%）、弧菌属（16.7%）、鲁杰氏菌属Ruegeria（6.7%）和芽孢杆菌属（5.3%）。

2.6 种水平的细菌组成结构分析

本实验从马氏珠母贝肠道及其养殖水体中共分离出可培养细菌56 种。其中有7 个种为2 个样品共有；18 个种为马氏珠母贝肠道特异性菌株；有31 个种仅从养殖水体种分离出来（表4）。

表4 马氏珠母贝及其养殖水体可培养细菌的群落组成（种水平）Table 4 Culturable bacterial community in Pinctada fucata martensii and water (in species)

马氏珠母贝肠道种γ-变形菌纲的弧菌占较大比例 (74.7%)，其中主要弧菌为新喀里多尼亚弧菌Vibrio neocaledonicus、强壮弧菌Vibrio fortis和坎氏弧菌Vibrio campbellii。而养殖水体种占优势的菌种为α-变形菌纲的FJ943236_s(40.7%)。

3 讨论

马氏珠母贝肠道匀浆液可培养细菌数量为1.72×105CFU·mL-1，大于其所在养殖水体2.15×104CFU·mL-1，这与其他贝类研究结果类似，例如紫扇贝幼体中可培养细菌数量比其养殖水体细菌大4 个数量级[23]。初步推测贝类可富集其周围环境微生物，这可能与宿主为肠道菌群提供所需的生境及营养物质有关[24]；支持了之前学者研究结果：水产动物肠道是许多细菌，包括致病菌的“储藏基地”[25]。

本研究分离获得马氏珠母贝肠道和养殖区海水中的可培养细菌分别为25 种和38 种，均隶属于变形菌门和厚壁菌门，其中变形菌门占绝对优势，相对丰度为分别为97.3%和91.3%。Liao 等[22]利用高通量测序研究发现，变形菌门和厚壁菌门是马氏珠母贝肠道中的优势菌门，其相对丰度分别为52.7%和23.2%。孙雪莹[26]研究发现，扇贝幼体不同发育时期及其育苗池水体中优势菌为变形菌门，其次为厚壁菌门。大扇贝（Pecten maximus）[27]、虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）[28]和牡蛎（Crassostrea gigas）[17]养殖水体优势门也为变形菌门。通过高通量焦磷酸测序研究3 种牡蛎样品细菌组成发现，主要优势菌均为变形菌门[29]。由此可见，海洋贝类细菌组成在门水平上存在极大相似性，变形菌门是贝类的常见细菌门类，其在不同贝类肠道中发挥的作用有待进一步研究。

本研究显示，马氏珠母贝肠道可培养菌的优势纲为γ-变形菌纲，芽孢杆菌纲其次。这与李明等[30]从虾夷扇贝分离的150 株细菌结果类似。Schulze等[31]运用DGGE 方法研究双壳贝类细菌群落组成发现，γ-变形菌纲是牡蛎成体、花斑鲍（Haliotis kamtschatkana）幼体、菲律宾蛤仔（Venerupis philippinarum）成体、太平洋潜泥蛤（Panopea abrupta）成体、虾夷扇贝成体的优势菌纲。本研究中，马氏珠母贝养殖海区可培养菌的优势纲为α-变形菌纲、γ-变形菌纲和芽孢杆菌纲，该结果与虾夷扇贝、紫扇贝（Argopecten purpuratus）养殖水体相关细菌群落结构一致[23,26]，γ-变形菌纲也是大扇贝幼体培育水体的主要细菌[32]。α-变形菌纲为大扇贝、太平洋牡蛎养殖海水中的第一优势纲[17,27]。

属水平上，本研究共获得马氏珠母贝肠道可培养细菌6 个属，主要优势属为弧菌属和假交替单胞菌属，分别占菌株总数74.7%和18.7%。Liao 等[22]通过高通量测序发现马氏珠母贝肠道细菌多样性丰富，其中未知细菌相对丰度为15.6%，主要可鉴定属为支原体属Mycoplasma（14.0%）、乳球菌属Lactococcus（10.9%）、假单胞菌属Pseudomonas（9.4%）和弧菌属（6.1%）。研究表明，弧菌属和假交替单胞菌属也是虾夷扇贝和紫扇贝肠道细菌的优势属[23,26]。Najiah 等[33]研究发现长牡蛎可培养细菌的优势属为假单胞菌属和弧菌属，而在热带牡蛎（C.iredalei）中，希瓦氏菌属和弧菌属是优势菌。香港巨牡蛎（C.hongkongensis）的相关研究同样发现了假交替单胞菌属、弧菌属、盐单胞菌属、希瓦氏菌属和芽孢杆菌属为其成体可培养细菌的重要属类[34]。这些研究进一步表明，双壳类的肠道可培养菌具有相似性。在养殖水体方面，本研究获得的可培养菌第一优势属为α-变形菌纲的FJ943236_g属，弧菌属为第二优势属。弧菌属和假交替单胞菌属曾从包括虾夷扇贝、大扇贝在内的鱼和贝类养殖水体中分离出来[31]。另外，地中海牡蛎养殖水体存在假交替单胞菌属和希瓦氏菌属[35]。弧菌属、假交替单胞菌属和希瓦氏菌属是欧洲牡蛎成体及养殖水体可培养细菌的优势菌[36]。

肠道和养殖水体中共有菌有芽孢杆菌属、假交替单胞菌属、发光杆菌属和弧菌属。芽孢杆菌属隶属厚壁菌门、芽孢杆菌纲，是养殖贝类和养殖水体中常见微生物类群。芽孢杆菌能改善水产动物肠道菌群结构，增加有益菌数量，抑制病原菌繁殖，从而增强肠道消化酶活性和免疫力，进而提高宿主生长[37]，是目前常用微生态制剂[38]。假交替单胞菌属、发光杆菌属和弧菌属都隶属变形菌门、γ-变形菌纲。Aranda 等[39]研究发现，假交替单胞菌DIT09、DIT44和DIT46 菌株对副溶血弧菌有较强的抑制效果，可作为新型抑菌剂。同样Kesarcodi-Watson 等[40]研究发现D41 菌株对灿烂弧菌有抑制效果，可以提高太平洋牡蛎的存活率。而Torkildsen 等[41]研究发现大扇贝幼体感染假交替单胞菌LT13 菌株后，死亡率高达67%。这些细菌对马氏珠母贝的作用还有待进一步研究，有望从中筛选出马氏珠母贝特异性益生菌。

弧菌属是2 个样品共有的优势菌，该属细菌分布广、种类多，在水产动物肠道及海水中常见，许多成员被认为是条件致病菌，能够引起鱼类、虾类和贝类的致病和死亡[42]。本实验中，马氏珠母贝肠道及其养殖水体中共有弧菌属的成员有坎氏弧菌Vibrio campbellii、哈氏弧菌V.harveyi和新喀里多尼亚弧菌V.neocaledonicus。其中哈氏弧菌是水产养殖动物的重要条件致病菌，常常能够导致水产动物在养殖过程中大量死亡[42]。研究发现，弧菌是扇贝幼体的主要致病菌[41]，Liu 等[35]从患病虾夷扇贝中分离出灿烂弧菌，感染实验证明此菌能使虾夷扇贝幼体大量死亡。

希瓦氏菌属和盐单胞菌属是肠道样品的特异性细菌，希瓦氏菌属在很多水生动物体内均有发现，该菌属对不同鱼虾的致病菌，如副溶血弧菌和哈维弧菌具有拮抗活性[43-44]。马氏珠母贝肠道特有菌的来源及希瓦氏菌属对肠道致病菌是否具有拮抗活性等还有待进一步研究。

本研究共获得马氏珠母贝肠道可培养细菌25种，隶属于2 个门、2 个纲、4 个目、5 个科和6 个属。课题组前期利用高通量测序研究发现马氏珠母贝肠道内共有932 种细菌，隶属于26 个门、53 个纲、83 目、143 个科和219 个属[22]。研究方法的显著差异是造成研究结果不完全一致的主要原因。基于高通量测序的宏基因组分析能获得样品中全部细菌基因组信息，进而还能对细菌群落结构及其代谢功能进行分析；基于分离培养技术开展菌群分析仅能获得可培养细菌的信息，但可以从中筛选、纯化专性益生菌，为开发生态健康养殖技术积累基础资料。

4 结论

马氏珠母贝肠道及其养殖海区水体可培养细菌均隶属于变形菌门和厚壁菌门，但门以下阶元尤其是属、种水平差异明显。马氏珠母贝肠道中的芽孢杆菌属、弧菌属和假交替单胞菌属的菌株具有作为益生菌开发应用的潜力。