一株分离自红树林沙雷氏菌的鉴定及杀虫活性测定

（广东海洋大学滨海农业学院，广东 湛江 524088）

黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens) 又称灵杆菌，属于肠杆菌科沙雷氏属一种产生鲜红色素的细菌，广泛分布于自然界，是水和土壤中的常居菌群。在害虫生防领域，目前已发现黏质沙雷氏菌对多种昆虫具有致病性，包括大蜡螟Galleria mellonella[1]、印度谷螟Plodia interpunctella[2]、地中海粉螟Anagasta kuehniella[2]、甜菜夜蛾Spodoptera exigua[3]、斜纹夜蛾Spodoptera litura[3]、小菜蛾Plutella xylostella[4]、马铃薯块茎蛾Phthorimaea operculella[5]、黑翅土白蚁Odontotermes formosanus[6]、德国小蠊[7]、蝗虫[8]、蚜虫[9]、天牛[10]等昆虫。另有报道黏质沙雷氏菌作为植物内生菌还能增强植株防御酶活性进而提高植物抗病性[11]，因此黏质沙雷氏菌在农业方面的应用备受关注。然而红树林特殊生境下分离到的黏质沙雷氏菌有何生理生化特点及其杀虫活性如何，未见相关报道。

本研究对分离自湛江红树林滩涂的菌株ZJ9通过形态观察、生理生化特性测定以及16S rDNA 序列测定分析，确定该菌株菌种，并就菌株ZJ9对草地贪夜蛾和大蜡螟幼虫的喂毒、血腔毒性进行测定，为该菌株用于控制农业害虫的微生物杀虫剂开发与应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

实验所用大蜡螟虫种购自天津惠裕德生物科技有限公司，为实验室长期人工饲养，饲料配方为麸皮60 g、面粉60 g、玉米粉60 g、酵母粉30 g、奶粉50 g、蜂蜜50 g、甘油50 mL。实验用大小一致的老熟幼虫。草地贪夜蛾种群为实验室采自湛江玉米地，在室内采用新鲜玉米叶进行饲养[12]，挑选3 龄幼虫进行试验。

1.2 供试菌株及其分离培养

菌株苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis（LWCC1017）购自上海鲁微科技有限公司，短隐杆菌Empedobacter brevis(GXW15-4) 购自镇江市润宇生物科技开发有限公司，大肠杆菌Escherichia coli(HB101) 购自Takara。

菌株ZJ9 分离自湛江沿海滩涂红树林，现保存于广东海洋大学海洋微生物实验室。在营养琼脂（NA）平板上划线恒温（30 ℃）培养24 h 后，观察菌落大小、形状、轮廓、透明度、隆起形状、边缘、气味及颜色等形态特征。细菌革兰氏染色和芽孢染色方法参考文献[13]。

1.3 生理生化反应

菌株的生理生化特性是对菌株种类进行分类鉴定的重要依据之一。测定该菌株15 个主要生理生化特性指标：丙二酸利用、柠檬酸盐利用、葡萄糖氧化发酵、阿拉伯糖发酵、木糖发酵、蔗糖发酵、山梨醇发酵、甲基红测定、乙酰甲基甲醇测定、淀粉水解、硝酸盐还原、吲哚反应、明胶液化、水杨苷反应、接触酶反应等，具体方法参考文献[13]。各生化反应实验前，先将该菌株进行平板划线，30 ℃恒温倒置培养24 h 后备用。

1.4 DNA 提取及16S rDNA 序列扩增

采用TIANGEN 公司的基因提取试剂盒提取菌株DNA并于-20 ℃保存。分子鉴定选用16S rDNA，引物为 27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT。PCR 反应体系:超纯水36.5 μL、Takara 10×PCR Buffer 5 μL、模板DNA 2 μL (100 ng)、dNTPMixture (2.5 mmol/L) 4 μL、引物（10 μmL/L）各1 μL、Taq 酶0.5 μL。PCR 扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min、50 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，35 次循环；72 ℃延伸10 min。利用琼脂糖凝胶电泳对PCR 产物进行初步检测，条带清晰的PCR 产物送往天一辉远生物科技有限公司进一步纯化和测序。

1.5 系统发育分析

采用NCBI 的Blast 程序进行比对，下载相似度大于90%的16S rNDA 序列以及该属中其他细菌的序列。所用序列菌名、登录号见图 2，以Escherichia coli作为外群。用ClustalX 1.83 进行序列比对、手工校对后，用 MEGA 7.0 邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树[14-15]。

1.6 生物测定

发酵液胃毒法：各菌株通过NA 平板活化后，在LB 培养基中30 ℃、180 r/min 培养24 h，然后以2%接种量二次发酵48 h 即为待测发酵液。用各发酵菌液浸泡玉米叶5 s，自然晾干后分别单头饲喂草地贪夜蛾3 龄幼虫，各3 次重复，每重复30 头。置于30 ℃恒温培养箱，统计各处理试虫1、3、5、7 d 死亡率。记录时以镊子碰触虫体尾部，不能正常爬行作为死亡标准，若发现叶片食尽则补充新鲜叶片。

注射法：待测发酵液经12 000 r/min 离心10 min 获得菌体，加入无菌水重现悬浮备用。使用尖头微量进样器（上海高鸽工贸有限公司）吸取5 μL菌体溶液，通过大蜡螟老熟幼虫的第一腹足，将菌体注射到幼虫体内。上清注射，以离心获得的菌体上清液，经针头过滤器（孔径为0.1 μm）过滤除菌后注射使用，注射方法同菌体注射法，无菌水为空白对照，各3 次重复，每重复10 头，30℃恒温下24 h 后统计死亡率并做比较。

1.7 数据处理

通过SPSS 20 对实验数据进行统计，以平均值±标准差表示，不同处理的死亡率进行差异显著性分析（Duncan 法多重比较，显著水平α为0.05），方差分析之前，先将百分率数据进行反正弦平方根转换。采用GraphPad Prism5 软件作图。校正死亡率公式如下：

校正死亡率=（处理死亡率-对照死亡率）/(1-对照死亡率)。

2 结果与分析

2.1 菌株ZJ9 的菌落形态及生理生化性状

经30 ℃恒温培养24 h 后，菌落为小菌落、近圆形，表面光滑，边缘整齐，不透明，突起为凸镜状，红色（图1）。革兰染色后镜检表明ZJ9 呈红色，短杆状，为革兰阴性菌。而芽孢染色实验表明ZJ9 无芽孢。菌株ZJ9 生理生化特性中丙二酸、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-蔗糖、D-山梨醇、明胶酶、吲哚、甲基红等指标均符合黏质沙雷氏菌的特性[13]。与同属其它沙雷氏菌区别在于格式沙雷氏菌S.grimesii木糖呈阳性、居泉沙雷菌S.fonticola丙二酸呈阳性、气味沙雷氏菌S.odorifera阿拉伯糖呈阳性、变形斑沙雷氏菌S.proteamaculans阿拉伯糖呈阳性、普城沙雷氏菌S.plymuthica木糖呈阳性、嗜线虫沙雷氏菌S.nematodiphila淀粉酶呈阳性、无花果沙雷氏菌S.ficaria阿拉伯糖和木糖呈阳性、S.ureilytica无颜色、甲基红呈阳性、木糖产酸等[16-18]。另外，本研究还测定了菌株ZJ9 柠檬酸盐、水杨苷、硝酸盐还原、接触酶等生理生化特性，详见表1。

2.2 菌株ZJ9 的分子鉴定

菌株ZJ9 的16S rDNA 测序大小为1 411bp（GenBank 登录号为MN420867.1），在NCBI 数据平台通过BLAST 同源性比较，菌株ZJ9 与黏质沙雷氏菌S.marcescens（登录号：FJ530951.1，KC171984.1）同源性达100%，与S.nematodiphila和S.ureilytica同源性分别为99.93%和99.79%。以16S rDNA 利用MEGA7.0 软件按Neighbor-Joining法构建了包括黏质沙雷氏菌及同属临近种细菌的系统发育树（图2）。菌株ZJ9 与Serratia marcescens、S.nematodiphila、S.ureilytica聚在同一分支上，遗传进化距离相近。结合菌株生理生化实验及16S rDNA 序列分析，菌株ZJ9 鉴定为黏质沙雷氏菌（Serratia marcescens）。

图1 ZJ9 菌落形态Fig.1 Colony morphology of ZJ9 strain

表1 菌株ZJ9 的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of ZJ9 strain

图2 邻接法构建的ZJ9 16S rDNA 序列的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain ZJ9

2.3 菌株ZJ9 杀虫活性

饲喂处理7 d 中，各处理组死亡率均有上升，其中非致病大肠杆菌与无菌水空白对照无显著差异。供试菌株中，苏云金芽孢杆菌、隐地杆菌、黏质沙雷氏菌校正致死率均在80%以上且显著高于大肠杆菌（F4,10=28.90,P＜0.05）。黏质沙雷氏菌处理1 d 时出现明显致死率并且显著高于苏云金芽孢杆菌和隐地杆菌，随后在5、7 d 时苏云金芽孢杆菌和隐地杆菌致死率超过黏质沙雷氏菌，但差异不显著（表2）。草地贪夜蛾幼虫被黏质沙雷氏菌感染后，身体变软，部分幼虫体色显红且体壁容易破裂流出体液（图3）。

表2 供试菌株对草地贪夜蛾3 龄幼虫的致死率比较Table 2 Comparison of the influence of the test strains on the mortality rate of the 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperda %

图3 被黏质沙雷氏菌感染的草地贪夜蛾幼虫Fig.3 Spodoptera frugiperda larvae infected by Serratia marcescens

通过对发酵液离心，血腔注射表明，ZJ9 菌体和上清液（无菌）均可致大蜡螟100%死亡，略高于苏云金芽孢杆菌菌体的致死率但显著高于其上清液致死率（F7,16=69.87,P＜0.05），实验中大肠杆菌的菌体和上清液注射后24 h 与无菌水一样无死亡（图4）。可见菌株ZJ9 发酵液中含有一些对大蜡螟高致死作用的活性成分。

图4 菌株ZJ9 对大蜡螟老熟幼虫的血腔毒性Fig.4 Hemocoelomotoxicity of strain ZJ9 to the mature larvae of Galleria mellonella

3 讨论

菌株ZJ9 菌落及发酵液均有明显红色，无芽孢、革兰阴性，这些特征从形态学角度可以初步鉴定为沙雷氏菌属[19]。对菌株ZJ9 16S rDNA 测序，生物信息学分析表明其与黏质沙雷氏菌同源性达100%。而与相近菌种嗜线虫沙雷氏菌Serratia nematodiphila和Serratia ureilytica可通过生理生化特性区分，淀粉酶呈阳性的为S.nematodiphila，甲基红呈阳性、木糖产酸的为S.ureilytica。根据是否产色素还可以将黏质沙雷菌分为2 个亚种[17]，为此ZJ9属于黏质沙雷氏菌粘质亚种(S.marescenssubsp.marcens）。然而黏质沙雷氏菌还可以分为10 个生物亚群100 多个血清型，要想进一步划分则需要进一步血清学鉴定。

研究表明黏质沙雷氏菌对昆虫、真菌、线虫等多种有害的生物均具有致病性[20-21]。其致病机理可能有多种：其一，黏质沙雷氏菌基因组中至少含有ChiA、ChiB和ChiC3 种几丁质酶基因，可以产生大量几丁质酶，这些几丁质酶可以提高苏云金芽孢杆菌杀虫效果，将ChiA转入水稻中还能提高水稻对纹枯病和稻瘟病的抗性[22]；其二，黏质沙雷氏菌产生的灵菌红素具有抗细菌、抗真菌、抗疟疾、抗藻类、抑制癌细胞、免疫抑制等多种生物学活性[23]；其三，菌体本身进入血腔大量增殖引起宿主患坏血症而死[16]。本研究中以大蜡螟为试虫时，发现ZJ9血腔毒性很高，其无菌上清液也具有很高致病性，这表明菌体外分泌的灵菌红素或其它活性成分对昆虫有明显致病性，同时从草地贪夜蛾幼虫喂毒死亡症状中可以看出该菌明显含有几丁质酶，致使虫体体壁破裂组织液化，而究竟哪种关键因子引起宿主发病值得进一步研究。另外，在如何提高菌株杀虫的效果方面还可以进行发酵条件优化和剂型研究。值得关注的是该菌对刚在我国定殖的草地贪夜蛾[24-25]低龄幼虫具有较高的致死率，这是首次报道，这将为利用细菌防治该虫提供新的选择。

总之，本研究通过菌落形态观察、细菌生理生化特性测定和分子鉴定三方面确定了分离自红树林的一株细菌 ZJ9 为黏质沙雷氏菌（Serratia marcescensZJ9）。该菌对草地贪夜蛾3 龄幼虫校正死亡率能达到80.21%。另外，血腔注射表明菌体及无菌上清液均具有很高致病性，在害虫生物防治方面值得进一步研究。