芒果苷对脂多糖诱导小鼠成骨细胞凋亡的影响及机制研究

陈则强，李昊

（广西医科大学口腔医学院口腔修复科，广西 南宁 530021）

慢性牙周炎是口腔疾病中最常见的慢性感染性疾病之一，可造成牙龈退缩、牙齿松动甚至移位等不良后果，影响口腔功能及美观。慢性牙周炎由多种因素引起，其中牙菌斑生物膜是引起牙周炎的始动因子，也是最主要的致病因素。牙菌斑的细菌中，革兰阴性细菌是其中最重要的致病菌之一。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰阴性细菌所独有的一种高度活性的致病物质，对牙周组织具有强烈毒性，其在牙周炎的发生发展中具有重要作用。研究表明，LPS可诱导小鼠成骨细胞炎性反应继而导致细胞凋亡[1]。

芒果苷（Mangiferin）是一种从百合科植物知母中提取的天然多酚类化合物，既往研究证明其具有良好的抗炎活性和抗凋亡作用[2-3]。但目前尚无研究探讨芒果苷对LPS 引起的牙周细胞凋亡是否同样有效，因此，本研究将小鼠成骨细胞株MC3T3-E1 细胞作为研究对象，采用脂多糖诱导成骨细胞凋亡，并加入芒果苷进行培养，探索芒果苷对LPS 诱导细胞凋亡的影响及可能的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠成骨细胞株MC3T3-E1 细胞购于上海拜力生物科技有限公司；α-MEM培养基、青链霉素混合液、PBS缓冲液、牙龈卟啉单胞菌LPS、芒果苷粉末购于美国Sigma-Al-drich 公司；四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购于成都嘉叶生物科技有限公司；TRIzol 试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量扩增试剂盒购于日本Takara公司；酶标仪、荧光定量PCR仪购于Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 成骨细胞分组 将小鼠成骨细胞以1×104/孔、每孔100 μL 细胞悬液接种于96孔板，均使用α-MEM培养基培养24 h。此后将细胞随机分成3组：对照组（只含成骨细胞）、LPS组（成骨细胞中加入LPS，并调节LPS 终浓度为1 μg/mL）、LPS+芒果苷组（在LPS 组基础上加入芒果苷，并调节芒果苷终浓度为40 μmol/L）。每组细胞均设6 个复孔，继续孵育72 h，进行后续实验。

1.2.2 MTT 检测检测细胞存活率 于各组每孔加入10 μL培养液并加入10 μL 0.5%MTT 溶液，继续培养4h 后终止培养，吸去孔内液体，每孔加入150 μL DMSO，摇床充分震荡使蓝紫色结晶物溶解，用酶标仪测定在570 nm 处各孔吸光度值，用于定量反映细胞存活率。细胞存活率为实验组吸光度与对照组吸光度的比值×100%。

1.2.3 qRT-PCR 检测 TNF-α、Bax、Bcl-2 和 Caspase-3 基因的mRNA 表达 采用胰蛋白酶消化收集各组细胞，按Trizol一步法提取总RNA，并进行浓度及纯度检验；取1 μL 各组样本的RNA 分别加入Quant cDNA 第一链合成试剂盒，按照试剂盒说明书操作的反应体系合成cDNA，反转录反应体系10 μL，反应条件为42 ℃、2 min，37 ℃、15 min，85 ℃、5 s终止反应，将逆转录产物于-20 ℃条件下保存备用；各基因的引物序列为 β-actin mRNA 正向：5’-TGTTACCAACTGGGACGACA-3’，反向：5’-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3’；TNF-αmRNA 正向 ：5’-TAGCCAGGAGGGAGAACAGA-3’，反向 ：5’-TTTTCTGGAGGGAGATGTGG-3’；Bcl-2 mRNA 正向：5’-GGACTTGAAGTGCCATTGGT-3’，反向：5’-AGCCCCTCTGTGACAGCTTA-3’；Bax mRNA正向：5’-CTGCAGAGGATGATTGCTGA-3’，反向：5’-GATCAGCTCGGGCACTTTAG-3’；Caspase-3 mRNA 正向：5’-ATGGGAGCAAGTCAGTGGAC-3’，反向：5’-CGTACCAGAGCGAGATGACA-3’。每个PCR 反应体系：2×Taq Plus PCR Master Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，cDNA 2 μL，双蒸水19 μL；PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃最终延伸5 min。PCR反应结束扩增后，记录每个样本每个基因荧光信号达到设定阈值时所经过的循环数（CT值），以β-actin为参照，计算各样本起始模板数的相对数量关系。每个样品中的基因相对mRNA表达采用相对定量公式2-ΔΔCT计算处理，其中ΔCT=目的基因CT 值-β-actin CT值，ΔΔCT=ΔCT（实验组）-ΔCT（对照组）。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计量资料以“±s”表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组MC3T3-E1 细胞存活率比较 与对照组相比，LPS组细胞存活率显著降低，与LPS 组相比，LPS+芒果苷组细胞存活率显著提高，组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 3组成骨细胞的细胞存活率比较Figure 1 Comparison of cell survival rates among the three groups

2.2 qRT-PCR检测结果比较 与对照组相比，LPS组成骨细胞TNF-α、Bax、Caspase-3 mRNA 表达均明显升高，而Bcl-2 mRNA 表达显著下降；与LPS 组相比，LPS+芒果苷组成骨细胞TNF-α、Bax、Caspase-3 mRNA 表达明显下降，同时Bcl-2 mRNA 表达显著升高。各项指标3 组间任意两组间差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 小鼠成骨细胞各基因mRNA相对表达量（±s）Table 1 Relative expression of genes of mouse osteoblasts(±s)

表1 小鼠成骨细胞各基因mRNA相对表达量（±s）Table 1 Relative expression of genes of mouse osteoblasts(±s)

组别对照组LPS组LPS+芒果苷组mRNA相对表达量TNF-α 1.00±0.05 5.83±0.62 4.16±0.57 Bcl-2 1.00±0.03 0.73±0.06 0.88±0.07 Bax 1.00±0.06 3.21±0.42 2.37±0.28 Caspase-3 1.00±0.08 4.07±0.54 2.95±0.36

3 讨论

作为口腔主要疾病之一，牙周炎不分地域、年龄，具有发病率高、病情反复等特点，是导致人体牙齿缺失的重要原因之一。慢性牙周炎是一种感染性疾病，其相关微生物主要是革兰阴性细菌。慢性牙周炎的主要特点是牙周支持组织的破坏，其中牙槽骨丧失是重要特征之一。成骨细胞是骨组织中的重要成分，其增殖与凋亡是影响牙周骨组织破坏程度的重要因素，而研究表明，革兰阴性细菌感染会诱导成骨细胞凋亡并抑制成骨细胞增殖[4]。LPS为一种脂质和多糖组成的复合物，是革兰氏阴性细菌细胞壁外膜中特有的一种化学成分，也是介导感染性炎症损伤最主要的病原分子之一。当细菌死亡或菌体崩解时，LPS 得以释放，其也可通过活细菌以胞壁发泡的形式释放。LPS可导致骨吸收，亦可加重骨吸收的程度。研究表明，牙龈卟啉单胞菌的LPS可抑制成骨细胞活力并促进成骨细胞凋亡[5]。本研究结果也证明LPS可诱导成骨细胞凋亡，与既往研究结果一致。

细胞凋亡也称程序性细胞死亡，是细胞为维持内环境稳定，由基因控制的一种自主、有序的死亡过程。此过程涉及一系列基因的激活、表达和细胞内多种蛋白及细胞外凋亡因子的调控。TNF-α 是一种重要的细胞炎症因子，实验证明TNF-α可促进成骨细胞的凋亡[6-7]。此外，Bcl-2家族是当前细胞凋亡研究的热点。Bcl-2 基因家族包括两类功能拮抗的基因，一类是抑制细胞凋亡的基因，如Bcl-2、Bcl-W、Bcl-XL、BF1-1 等；另一类是促进细胞凋亡的基因，如Bax、Bak、Bcl-XS、Bok 等。其中Bcl-2、Bax 是两类基因中最重要的调控基因。Bcl-2可通过影响内质网内Ca2+的释放维持线粒体的跨膜电位，抑制线粒体释放细胞色素C 并抑制Caspase-9等的活化，从而发挥抑制细胞凋亡的作用，导致细胞数量的相对增多[8]。与之相反，Bax 基因是Bcl-2 基因家族中的一个凋亡促进基因，Bax可与Bcl-2形成异源二聚体，两者相互之间具有拮抗作用，Bax 通过抑制Bcl-2 的活性发挥凋亡促进作用，研究表明其能促进细胞凋亡[9]。Caspase 家族是目前最受关注的细胞凋亡调控因子，是细胞凋亡过程中的关键元件，其他通路引起的细胞凋亡最终汇集到中心环节Caspase蛋白。其中Caspase-3被称为“死亡执行蛋白酶”，是细胞凋亡最终执行者，若Caspase-3 在细胞内受到激活，细胞便会进入凋亡过程[10]。

芒果苷又称芒果甙、知母宁，是漆树科植物芒果叶的主要活性成分。近年来大量药理和临床研究证明，芒果苷具有多种药理效应，如抗病毒、抗炎、抗糖尿病、抗氧化、抗过敏、抗癌等作用[11-13]。目前有关于芒果苷抑制成骨细胞凋亡的报道显示，芒果苷预处理后可显著降低地塞米松诱导的细胞凋亡，并使凋亡相关因子Bcl-2 和Bax 等向抑制凋亡的方向转变[14]。Li Y 等[15]学者对骨关节炎的研究也表明，芒果苷可上调抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达。叶菁等[16]通过实验研究发现，芒果苷可明显下调实验性脑瘫大鼠皮质区Bax、caspase-3 蛋白表达，而同时上调Bcl-2 蛋白表达，从而抑制脑瘫模型大鼠皮质区神经细胞的凋亡。

本研究结果显示，LPS组MC3T3-E1细胞存活率较对照组明显降低，qRT-PCR 检测结果显示TNF-α、Bax、Caspase-3 mRNA 基因表达明显升高，Bcl-2 mRNA 基因表达明显下降，表明LPS 可诱导小鼠MC3T3-E1 细胞的凋亡；而与LPS 组相比，LPS+芒果苷组MC3T3-E1细胞存活率明显提高，qRT-PCR检测结果显示TNF-α、Bax、Caspase-3 mRNA 基因表达显著下降，Bcl-2 mRNA 基因表达显著升高，表明芒果苷可能通过抑制LPS 诱导的TNF-α 形成及调节细胞内产生Bax、Bcl-2、Caspase-3 而发挥抗细胞凋亡的作用，提示芒果苷有望作为治疗慢性牙周炎的辅助药物。

综上所述，芒果苷可改善LPS 导致的成骨细胞凋亡，其作用机制可能与芒果苷抑制LPS 诱导的TNF-α 形成及调节细胞内Bax、Bcl-2、Caspase-3产生有关，但细胞凋亡机制十分复杂，其信号通路也错综复杂，具体调控机制仍需进一步探索。