悬浮培养肿瘤细胞的生物钟同步化细胞模型建立及其在择时给药研究中的应用

秦文娟，潘梅萍，苏泽杰，侯茹蓉，陆海杰,3*，乐志操

(1.厦门大学附属中山医院肿瘤放疗科，福建厦门361004；2.福州大学生命科学研究所，福建福州350116；3.福建医科大学附属协和医院放疗科，福建福州35001;4.深圳大学医学部，卡尔森国际肿瘤中心，广东深圳518060)

生物钟，即对生命活动的昼夜节律控制，在多方面影响人体健康[1-2].生物钟节律的破坏与肿瘤的发生密切相关，对肿瘤治疗也有重要影响[1-4].目前有很多研究试图开发调控生物钟的小分子药物，以促进对代谢疾病和肿瘤的治疗[5-8].

中枢生物钟由大脑海马区的视交叉上核控制，在光照的影响下形成周期性的基因表达模式，并通过激素及其他信号分子调控外周组织的生物钟[1,9].中枢生物钟与外周组织的生物钟如何偶联并受到调控是一个重要问题，但具体机制至今仍不清楚.通常认为生物钟节律在基因的转录和蛋白质的稳定性方面受到多重反馈机制的调控，其中最重要的是CLOCK与BMAL1组成的转录活化因子复合体，以及PERIOD(PER)与CRYPTOCHROME(CRY)组成的转录抑制因子复合体，共同调节相关基因的周期性表达[1].此外，神经肽、激素(如褪黑素和甲状腺素)、环磷酸腺苷(cAMP)、钙离子信号、核因子κB(NF-κB)信号等都可以调节生物钟的周期性和相关基因的表达[10-15].

虽然生物钟相关基因在每个细胞中都有表达，但是因其节律是独立调控的，故在体外培养的情况下缺乏整体的同步化机制.为此，有研究开发了单细胞报告基因技术，在单细胞水平进行实时检测[8]，但该方法并不容易进行.为了在培养肿瘤细胞的群体水平观察到周期性的生物钟相关基因表达，有研究者提出通过添加Forskolin活化cAMP信号通路，对培养细胞的生物钟进行同步化处理[13].为了更好地观察到周期性的生物钟相关基因表达，人们还开发了增强生物钟节律的小分子药物如Nobiletin，以提高观察效果[8].然而，在体外培养的细胞群体中仍然难以实现周期性的生物钟相关基因表达.

生物钟对肿瘤治疗的效果及预后有重要影响[16-22].根据生物钟调节组织细胞活性的作用，人们形成了时辰放化疗的概念，即根据特定的生物节律给予治疗，可以看到肿瘤细胞不同的反应情况，有望增强治疗效果并降低副作用[23-27].在体外培养系统中获得并维持生物钟同步化的肿瘤细胞是研究的一个难点.为此，本研究采用悬浮培养的方法，维持细胞间通讯，以有效实现生物钟同步化，同时将其用于进一步的择时给药实验以评估化疗药物的时辰反应.

1 材料和方法

1.1 材 料

人结肠癌细胞HCT116购自中国科学院细胞库(上海，目录号TCHu 99)，细胞培养采用的DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)购自ThermoFisher公司(Gibco)，胎牛血清购自Hyclone公司.Forskolin购自Sigma-Aldrich公司(F6886)，Nobiletin购自MedChemExpress公司(HY-N0155)，提取细胞总RNA采用的Trizol试剂购自南京诺维赞生物科技有限公司(R401-01)，反转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)购自Fermentas公司(K1622)，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)反应试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司(CW0957)，其他生化试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司.qRT-PCR在Roche LC-480 qRT-PCR仪上完成，细胞观察采用Nikon Eclipse Ti倒置荧光显微镜，台盼兰(上海碧云天生物技术有限公司，C0011)活性染色照相采用Leica DM6000B正置显微镜.

1.2 细胞贴壁培养

HCT116细胞在完全DMEM(含10%(体积分数)胎牛血清)中，于37 ℃、5%(体积分数)CO2的湿润培养箱中培养.细胞长满后以1∶3稀释传代至24孔板中.待细胞长满后，加入含10 μmol/L Forskolin的完全DMEM进行2 h同步化处理，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤一次，再加入含5 μmol/L Nobiletin的DMEM完全培养基增强生物钟基因表达.每4～6 h取样一次，各孔作为一个独立样品.

1.3 细胞悬浮培养

悬浮培养采用6 cm 细菌培养板(Biofil,广州洁特生物过滤有限公司)，每板加入数量为2×106的HCT116细胞.培养2 d后，加入含10 μmol/L Forskolin的完全DMEM进行2 h同步化处理，然后用PBS洗涤一次，加入含5 μmol/L Nobiletin的完全DMEM增强生物钟基因表达.每6 h取样一次，取样时以200 μL吸头取约50 μL细胞培养液进行基因表达分析.细胞活性通过0.1%(质量分数)台盼兰染色检测，按照试剂盒说明操作.

1.4 细胞总RNA提取和qRT-PCR

细胞总RNA提取采用Trizol法，按照试剂盒说明操作.总RNA经DNA酶消化后反转录为cDNA.经凝胶电泳检验基因扩增的特异性后，进行qRT-PCR基因表达定量分析.PCR条件：95 ℃变性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环；72 ℃延伸10 min.采用β-ACTIN作为参比基因，以2-ΔΔCT方法计算基因的相对表达量[28].所用引物及序列见表1.

表1 本研究所用引物及其序列Tab.1 Primers used in this study and their sequences

1.5 数据分析

所有实验均重复3次，数据以平均值±标准差表示.差异显著性分析采用双尾t-检验，显著性水平表示如下：***p<0.001.

2 结果与分析

2.1 HCT116细胞模型中生物钟基因的动态表达情况

采用HCT116细胞为模型，检测其生物钟相关基因的动态表达情况.对照组中，传代后的细胞未进行处理，在不同时间点进行取样检测发现CLOCK、BMAL1、PER2基因的表达均未表现出明显的周期性特征(图1(a)～(c)).当以10 μmol/L Forskolin处理2 h对细胞进行生物钟同步化后，再继续培养于含5 μmol/L Nobiletin的条件下，可以看到CLOCK和PER2的表达表现出一定的24 h周期性特征(图1(d)和(f))，但BMAL1的表达仍没有同步化(图1(e)).因此，在贴壁培养的肿瘤细胞模型中，很难在群体水平获得周期性的生物钟基因表达模式.

(a～c)对照组；(d～f)同步化处理组.图1 同步化处理对贴壁培养的HCT116细胞生物钟基因表达的影响Fig.1Impact of synchronization on the biological clock gene expression in monolayer cultured HCT116 cells

2.2 悬浮培养的HCT116细胞中生物钟基因表达情况

为了维持培养细胞间的联系和通讯，参考胚胎干细胞培养中在低黏附的细胞培养板上形成胚样小体以进行体外细胞分化的方法[29]，将肿瘤细胞在低黏附的细菌培养皿中进行悬浮培养，使细胞保持在同样的环境中，且可以定时多次取样分析.在这种培养条件下，细胞保持悬浮状态，与同时期贴壁培养的细胞相比数目略有减少，但仍保持正常扩增(图2)，可见该方法可以保持肿瘤细胞的活性.

图2 悬浮培养与贴壁培养的HCT116细胞生长情况Fig.2Growth of suspension and monolayer cultured HCT116 cells

对悬浮培养的HCT116细胞进行基因表达检测.在未经Forskolin 同步化处理的悬浮培养细胞中，周期性的生物钟基因表达不明显(图3(a)～(c))；经同步化处理后，3个生物钟相关基因CLOCK、BMAL1和PER2均表现出一定周期性的动态表达(图3(d)～(f)).可见通过同步化处理以后，悬浮培养的肿瘤细胞可以表现出生物钟的节律性.

2.3 悬浮培养的HCT116细胞对化疗药物的时辰反应

(a～c)对照组；(d～f)同步化处理组.图3 悬浮培养的HCT 116细胞生物钟基因的周期性表达Fig.3Periodic rhythm expression of biological clock genes in suspension cultured HCT116 cells

(a)同步化的细胞对化疗药物5-FU的时辰反应;(b)未同步化的细胞(1 h)对化疗药物5-FU的反应差异.***p<0.001.图4 HCT116细胞对化疗药物5-FU的时辰反应差异Fig.4Differences in circadian clock response of HCT116 cells to chemotherapeutic drug 5-FU

为检验上述悬浮培养方法是否能用于评价化疗药物的时辰反应，将治疗结直肠肿瘤的药物5-氟尿嘧啶(5-FU)在不同节律点加入，检测其引起肿瘤细胞反应的差异，包括对生长和凋亡基因P21和FAS的表达调控[23-25].结果显示：在同步化处理4或20 h后加入5-FU均不能引起显著的反应，而在同步化处理12 h 后加入5-FU则引起了P21和FAS基因表达水平的显著上升(图4(a))，由此表明悬浮培养的肿瘤细胞可以表现出对化疗药物的时辰反应；如不添加Forskolin进行生物钟同步化处理，则5-FU 不能引起P21和FAS基因的表达变化(图4(b))，这可能是因为培养体系中加入的Nobiletin具有抗氧化剂的功能，对细胞起到了一定的保护作用.在未同步化的细胞培养体系中，如不添加Nobiletin，可以看到P21基因的表达变化不显著，而FAS基因的表达明显上升(图4(b))，说明化疗药物5-FU本身可在1 h内引起明显的基因表达变化，但不同基因的表达动态存在一些差异.

3 讨 论

3.1 生物钟的同步化新方法

营养、激素和神经肽等分子都是调控外周生物钟的分子[10-15]，但在体外培养的肿瘤细胞中缺乏这些校准和调控因素.因此，尽管每个细胞都表达生物钟相关基因，但是在群体水平上这些生物钟无法同步化且不能形成周期性的基因表达模式.本研究结果表明，即使进行了同步化处理，若细胞培养于不同条件(如不同培养孔)，一旦失去相互通讯和群体水平的调控，其周期性节律也会很快丢失.因此，推测生物钟的同步化与体内各组织器官和细胞间的通讯密切相关.

为了实现体外培养的肿瘤细胞中生物钟相关基因的周期性表达，本研究借鉴了胚胎干细胞体外分化所采用的悬浮培养方法[29].另有研究提出对肿瘤组织进行类器官(organoid)培养，也是在类似低黏附的情况下进行细胞团悬浮培养[30-31].本研究结果表明，在这种情况下对细胞进行同步化处理后，能够较好地保持一致的生物钟基因表达动态.肿瘤细胞获得不依赖于基质的生存和迁移能力后，在不贴壁的情况下仍然能够保持正常生长和活力，这与正常组织细胞有较大区别，也是本研究中能够进行悬浮培养的保障.本研究的方法在原理上与这些方法类似，但操作简单，且对培养板的材料选择不需要具有细胞贴壁的功能，可更加广泛地应用.

3.2 时辰放化疗

前期较多报道[23-27]发现不同时间段给药后，肿瘤对放化疗的反应有较大差异，因而形成了时辰放化疗的概念.许多临床实验发现，与常规化疗模式相比，包括卵巢癌[32]、肺癌[33]、胶质母细胞瘤[34]等疾病，时辰化疗在不降低疗效的前提下，明显降低了药物毒副作用，提高了治疗的依从性.这与机体自身的生物钟节律相关，也与药物的代谢动力学密切相关.选择合适的用药时机，有望达到最大化的杀伤肿瘤细胞效果和最小的毒副作用，从而改善患者生存质量.

5-FU是治疗消化道肿瘤常用的化疗药.研究表明，5-FU代谢的限速酶二氢嘧啶脱氢酶(DPD)的昼夜分泌具有明显的节律性，从22：00—次日10：00 连续12 h给药，最佳给药时间是凌晨4：00，其活性较其他时间提高了50%以上[23].本研究也发现，在同步化处理12 h 后，5-FU引起了最强的P21和FAS反应，而其他时间给药或未同步化处理的细胞则没有明显反应.因此，生物节律确实可以导致不同的药物反应，为时辰化疗的概念提供了支持证据.后续研究将针对生物节律如何导致药物反应差别进一步探讨.其他药物如顺铂、草酸铂等也表现出显著的时辰治疗效应[23-27].本研究中基于悬浮细胞的系统也适用于探讨这些药物的生物节律反应特征.

4 结 论

本研究建立了在体外细胞悬浮培养中同步化生物钟的新方法，并基于该方法对肿瘤细胞的时辰给药反应进行了探讨，发现同步化的细胞对化疗药物表现出明显的时辰反应.作为原理验证，在此只检测了一种细胞类型，但理论上该方法可以应用于其他类型的肿瘤细胞培养，从而有助于生物钟与肿瘤治疗的相关研究，可进一步丰富我们对生物钟如何影响肿瘤治疗的认识.