软肝颗粒抑制血管新生的抗肝纤维化作用机制研究*

钟培玲 陈英杰 柳 臻 朱倩欣 贺劲松△

1.广州中医药大学第四临床医学院2018级硕士研究生班 (广东 深圳， 518033) 2.广州中医药大学第四临床医学院2017级硕士研究生班 3.深圳市中医院肝病科

肝纤维化是指各种原因引起肝脏慢性损伤后的一种修复应答，是多种慢性肝脏疾病的共同病理过程，也是发展为肝硬化的必经阶段。细胞外基质过度沉积及肝星状细胞(HSC)的活化是其主要发病机制。血管新生是肝纤维化发展过程中的重要病理过程，被认为是肝纤维化的前奏[1，2]。已有研究表明，抑制血管新生能有效抑制纤维化的形成[3]。血管新生成为肝纤维化形成与逆转的关键环节。软肝颗粒是我科治疗肝纤维化、肝硬化的有效中药复方，既往研究发现，软肝颗粒联合恩替卡韦可以进一步提高肝脏纤维化逆转率[4]。可能通过以下机制发挥抗肝纤维化作用[5,6]：①下调PBMC中TGF-β1mRNA和上调IFN-γ和IL-8 mRNA表达；②抑制AngⅡ诱导HSC上调基因的表达。但没有从血管新生的角度对软肝颗粒抗肝纤维化进行相关研究,本研究探讨软肝颗粒抑制血管新生的抗肝纤维化机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取 2016年9月至2017年8月我院乙型肝炎进展性肝纤维化患者90例，其中男68例，女22例，年龄19～64岁，平均(39.62±9.61)岁。按2∶1比例随机分为治疗组和对照组。使用交互性语音应答系统(IVRS)进行随机化管理。研究者通过电话与IVRS系统联系，输入相关数据，系统将自动进行随机化。治疗组60例(男45例，女15例)，平均年龄(39.10±10.27)岁；BMI均值为(21.61±1.50)kg/m2。对照组30例(男23例，女7例)，平均年龄(40.67±8.21)岁；BMI均值为(21.73±1.57)kg/m2。两组患者在一般资料方面均衡可比。患者入组时，一般情况以及肝脏硬度值(LSM)、肝脾超声积分、脾脏厚度方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 诊断标准 现代医学诊断标准参考2015年版《慢性乙型肝炎防治指南》中标准[7]：①血清HBsAg阳性，HBV DNA定量≥2 000 IU/ml，HBeAg阳性或阴性；②ALT>50 U/L；③组织学、影像学、生化学或血液学检查提示有门静脉高压症或肝细胞合成功能障碍的证据，无腹水、食管胃底静脉曲张破裂出血或肝性脑病等。中医学诊断标准参考2010年版《肝纤维化中西医结合诊疗指南》中的中医证型诊断标准[8]，符合气虚血瘀夹湿热证。主症：①神疲乏力，面色晦暗；②肝区不适或胀或痛，痛处固定；③口干口苦或口臭；④舌质暗或有瘀斑、瘀点，苔黄腻；次症：①胁痛入夜尤甚；②大便黏腻臭秽或干结；③纳呆，胃脘胀闷；④病程较长，久痛不已； ⑤脉弦数。凡具备主症 2项、次症1项或主症1项、次症3项者均属本证。

1.3 纳入排除标准 纳入标准：①符合上述诉诊断标准；②18岁≤年龄≤65岁；③肝组织病理学≥S3，或肝脾超声积分>8分，或FibroScan肝脏硬度值>12.4 kPa；④患者签署知情同意书后，自愿参加本研究。排除标准：①HBsAg阴性；②Child-Pugh积分≥7分；③同时感染HIV、HCV、HDV者；④合并代谢性或自身免疫性肝病者；⑤肝癌患者；⑥精神病和其他严重脏器疾病者；⑦怀孕或哺乳期妇女；⑧有滥用酒精或非法药品史者，30天内参加其他肝炎药物的试验者；⑨不能够或者不愿意签署知情同意书或不遵守研究规定者；⑩对试验药物过敏者。

1.4 治疗方法 对照组患者口服恩替卡韦(百美施贵宝公司生产，0.5 mg/片)0.5 mg/次，1次/d。治疗组患者在此基础上加用软肝颗粒，方由叶下珠、黄芪、生地黄、当归、五味子、丹参、桃仁、三七、穿山甲(炮)、鳖甲(制)、枳壳、茯苓组成。由具有GMP认证的深圳三九制药厂按中药颗粒剂制备，规格20 g/袋，1袋/次，温开水冲至150 ml，饭后服用，2次/d。两组患者疗程均为96周。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 肝组织病理学检查 在彩色超声引导下行经皮肝脏穿刺活检。肝穿刺标本长度超过1 cm，至少包括6个以上肝小叶范围。肝组织标本用甲醛固定后，送深圳市中医院病理科，行石蜡包埋，连续切片，常规做苏木精-伊红、Masson三色染色和(或)网状纤维染色，由2名资深病理医师单独阅片，进行Knodell、Ishak评分[9,10]，在治疗前及治疗96周时各行肝穿刺1次。对比前后评分变化。

1.5.2 Fibroscan测定肝脏硬度值(LSM) 将Fibroscan仪器(法国Echosens公司产品)M型探头(3.5 MHz)置于患者右腋前线至右腋中线第7、8肋间或第8、9肋间，连续测量弹性数值10次，取中位数作为LSM评估肝脏硬度或肝纤维化程度。LSM越大表示肝组织质地越硬，纤维化程度越严重。分别在治疗前及治疗48周及96周时各检查1次。对比前后硬度值变化。

1.5.3 肝脾超声积分 采用彩色超声检查肝实质、肝脏表面、肝脏边缘、肝静脉的情况，并测量计算脾脏面积。最终计算肝脾超声参数积分以评估肝脏的纤维化、硬化程度[11]。在治疗前及治疗48周，96周时各检测1次。具体积分标准见表1。

表1 肝脾超声参数积分标准

1.5.4 血清低氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)水平检测 采取患者外周血2 ml，离心，取血清，ELISA法检测，采用美国R&D公司试剂盒，在治疗前和治疗96周时各检测1次。

1.5.5 检测肝组织HIF-1α、VEGF表达 在治疗前及治疗96周时分别行肝穿刺取肝组织，按1.5.1中方法处理，采用免疫组织化学法检测HIF-1、VEGF的表达情况，免疫组化超敏试剂盒及DAB显色试剂盒购自福建福州迈新生物技术开发有限公司。

1.5.6 肝组织的微血管密度(MVD)水平计算 在治疗前及治疗96周时，按上述方法取得肝组织冰冻切片。参照Weidner等[12]的方法，通过免疫荧光检测CD31蛋白表达计算MVD，低倍镜下观察整个切片，寻找血管密度最高的区域，然后高倍镜下每张切片随机选取5个视野，采用image proplus 6.1图像分析软件计算每个视野阳性染色微血管数目，并求平均值。

2 结果

因肝活检穿刺为有创检查，部分患者拒绝进行第二次肝活检穿取标本，因此本研究最后对照组只有26例，治疗组有52例患者完成二次肝穿活检。

2.1 两组患者治疗前及治疗96周时肝组织Knodell、Ishak评分情况 见表2。

表2 两组患者治疗前及治疗96周时肝组织两项评分比较

2.2 两组患者治疗前及治疗两时段时LSM、肝脾超声积分检测结果 见表3。

表3 两组患者治疗前及治疗两时段时LSM、肝脾超声积分比较

2.3 两组患者治疗前后血清中HIF-1α、VEGF检测结果 见表4。

表4 两组患者治疗前后血清中HIF-1α、VEGF结果比较

2.4 两组患者治疗前后肝组织中HIF-1α、VEGF、MVD检测结果 见表5。

表5 两组患者治疗前后肝组织中3项指标结果比较

3 讨论

近年来通过抑制血管增生进而阻止肝纤维化的发生成为研究的热点。血管新生是一种缺氧启动、生长因子依赖的动态病理过程，HIF-1在细胞受低氧刺激时诱导产生并活化，是组织缺氧的直接反映与重要标志[13]。血管增生程度取决于缺氧的程度及细胞对HIF的反应[14]。研究证明，HIF-1α是一种受细胞内氧浓度调节的转录因子，随着肝损伤加重，组织缺氧区域扩大，HIF-1α高表达，可刺激HSC激活并通过诱导下游VEGF因子表达和转录，还可增强VEGF mRNA的稳定性，促进形成新血管，改善局部组织血供，暂时缓解肝组织的缺氧程度，但这种异常的血管增生从长远来看却是有害的[15,16]。VEGF是目前所知作用最强的直接作用于血管内皮细胞的促血管生成因子，可特异性地促进内皮细胞分裂、增殖和移动，增加血管通透性，在血管形成中起重要作用[17,18]。众多研究结果显示，随着肝纤维化程度的加重，肝纤维化患者血清VEGF水平逐渐升高,因此，调控HIF-1α及VEGF的表达，有望成为抑制肝纤维化的有效方法[19-21]。微血管密度MVD是判断有无血管新生的特异性指标，吕靖等[22]发现随着肝纤维化程度加重，微血管的数目或者微血管密度增加，这种病理性血管增生可能通过上调HIF-1α VEGF信号通路中有关信号分子的基因和蛋白表达而实现的。

中医学理论中无肝纤维化病名，历代医家根据患者症状、体征将其分属于“鼓胀”“胁痛”“癥瘕”“积聚”等范畴，认为肝纤维化的根本病因是正气亏虚、湿热疫毒内侵，导致肝失调达、肝气郁结、瘀阻脉络。肝病日久，可累及脾肾二脏，三脏亏虚，湿热、瘀毒与正虚相互夹杂，发为本病。因此，湿热久居肝脾，气虚血瘀为其基本病机。软肝颗粒是我科临床治疗肝纤维化、肝硬化的常用药物，多年来不断改善配伍。组方针对肝硬化的病机特点，配伍主次有度，方中以穿山甲、鳖甲为君，软肝散结；三七、桃仁、当归、丹参为臣，活血化瘀；黄芪、枳壳、茯苓为佐，健脾益气利湿；生地黄、五味子、叶下珠为佐，清热解毒养肝。现代药理研究表明，叶下珠有一定的保肝及直接抗HBV作用；黄芪、生地黄均有增强机体免疫功能的作用；当归除提高免疫功能外还有保肝、抗肝纤维化的作用；五味子有较强的护肝及调节免疫功能作用；丹参、桃仁、三七、鳖甲均证实有抗肝纤维化作用。

本研究结果提示软肝颗粒能够抑制肝组织及血清中HIF-1α、VEGF细胞因子的表达，改善肝硬化患者组织微血管密度，减轻肝纤维化程度，延缓病情进展，临床疗效满意。

软肝颗粒具有抗纤维化作用，其与下调细胞因子、抑制血管新生相关。随着对细胞因子与血管新生，及血管新生与肝纤维化作用机制的进一步深入研究，将来可能可以通过抗体或基因水平干预这些因子及其受体的作用，从而抑制细胞缺氧及血管生成，从而抑制肝纤维化，防止肝纤维化向肝硬化进展。