截断法与逆挽法治疗慢加急性肝衰竭的网络药理学研究*

迪力甫沙·地力木拉提 马重阳 张秋云

首都医科大学中医药学院中医络病研究北京市重点实验室 (北京， 100069)

钱英教授是全国老中医药专家学术经验继承指导教师，全国名中医，首都国医名师。钱老结合临床经验拟定截断逆挽方治疗慢加急性肝衰竭(ACLF)的疗效已被多项实验与临床研究证实[1-3]。截断逆挽方中融合的治法为截断法(清热解毒、凉血化瘀)和逆挽法(健脾益气、滋补肝肾)，由叶下珠、瓜蒌、金钱草、生黄芪、槲寄生、三七、莪术、丹参、生地黄、黑附片10味药组成，对应了ACLF本虚标实的基本病机，是临床治疗该病的代表方[4]。本研究利用网络药理学的方法，分别比较截断逆挽方中截断法和逆挽法药物的活性成分与靶点信息，探讨截断法和逆挽法在ACLF治疗中的潜在生物学内涵。

1 资料与方法

1.1 截断逆挽方活性成分的收集与筛选 本研究利用TCMSP平台并检索pubmed数据库收集截断逆挽方的所有成分，设置药物成分的OB↑≥30%，DL↑≥0.1，CACO-2↑≥0作为条件筛选截断逆挽方的活性成分。

1.2 截断逆挽方活性成分作用靶点的收集 利用TCMSP数据库获取截断逆挽方中筛选出的每个活性成分对应的潜在靶点信息，并将不同来源的靶标在UniProt(http://www.uniprot.org)数据库中检索，得到所有靶点的基因名，用于后续网络药理学分析。

1.3 截断逆挽方活性成分-靶点相互作用网络的构建 研究将截断逆挽方中10味药分截断组和逆挽组展开研究，其中截断组药物有清热解毒、凉血化瘀的功效，包含叶下珠、瓜蒌、金钱草、莪术、丹参、三七、生地7味药；逆挽组药物有健脾益气、滋补肝肾的功效，包括生黄芪、槲寄生、黑附子3味药。利用Cytoscape 3.6软件构建截断逆挽方活性成分-靶点相互作用网络，并对活性成分进行分类注释，分为截断组成分、逆挽组成分和两组共有成分3个类型。

1.4 截断逆挽方靶点参与生物学过程的富集分析 用DAVID数据库对上述相互作用网络中靶点进行生物学过程的富集分析，初步得到截断逆挽方全方抗ACLF的作用特点。

1.5 截断法和逆挽法靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建 利用String数据库，对截断逆挽方中截断组药物活性成分对应靶点和逆挽组药物活性成分对应靶点分别进行蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析，分别构建两个PPI网络。利用Cytoscape3.6插件Network Analyzer计算节点度，评价靶点在网络中的重要性。

1.6 截断法和逆挽法靶点KEGG信号通路富集分析 利用DAVID数据库，对截断逆挽方中截断组药物活性成分对应靶点和逆挽组药物活性成分对应靶点分别进行KEGG信号通路分析，比较两组富集到的生物信号异同。

2 结果

2.1 截断逆挽方的活性成分与靶点相互作用网络 研究经TCMSP数据库及文本检索后进行OB值和DL值筛选，得到了截断逆挽方的药物活性成分，其中叶下珠8个，瓜蒌14个，金钱草8个，莪术3个，丹参67个，三七9个，生地黄3个，生黄芪24个，槲寄生7个，黑附子17个。去除重复成分后，截断组药物共有88个活性成分，逆挽组药物共有32个活性成分，两组之间存在6个共有成分。利用Cytoscape软件构建截断逆挽方活性成分-靶点相互作用网络，该网络包含254个节点，2 191条边(见图1)。网络中可观察到有76个活性成分作用在PTGS2靶点上，69个活性成分作用在NOS2靶点上，61个活性成分作用在GSK1B靶点上，这些活性成分在截断组和逆挽组均有分布，表明截断组药物成分和逆挽组药物成分在不同靶点上均具有一定的协同作用。

图1 截断逆挽方成分-靶点相互作用网络

2.2 截断逆挽方靶点参与的生物学过程富集 研究利用DAVID数据库对截断逆挽方相关靶点进行生物学过程的富集分析，发现截断逆挽方可能参与了多条与ACLF相关的生物学过程，以P值排序，排名前10 的生物学过程分别是对缺氧的反应、正调控细胞增殖、对有毒物质的反应、诱导MAPK活性、血小板激活、细胞增殖、细胞对脂多糖的反应、负调控凋亡过程、正调控活性氧的代谢过程等(表1)。

表1 截断逆挽方靶点参与的生物学过程

2.3 截断逆挽方靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络 利用String数据库，我们对截断法和逆挽法的药物相关靶点进行PPI分析及网络构建，分别得到了包含145个节点，1 484条边和129个节点，1 240条边的PPI网络。拓扑分析以Degree值排序，截断法与逆挽法药物PPI网络中排名前5的靶点均为IL6(67/63)、VEGFA(62/58)、TP53(59/56)、TNF(58/56)、MAPK1(57/55)。此外研究发现，同一靶点在两个PPI网络中的重要性也有不同，如在PPI网络中BCL2排序两者相差30，THBD排序则相差21，TOP2A排序相差17。

2.4 截断法、逆挽法药物靶点KEGG信号通路分析 利用DAVID数据库对截断法药物靶点和逆挽法药物靶点分别进行KEGG信号通路分析，以探讨这些药物的潜在生物学内涵。结果显示截断法、逆挽法的靶点可在相同的KEGG信号通路中显著富集，这些信号通路可能是截断逆挽方抗ACLF的药理机制(表2)。这些信号包括神经活性配体-受体相互作用、TNF信号通路(TNF)、HIF-1信号通路(HIF-1)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt)、缝隙连接、乙型肝炎、雌激素信号通路、T细胞受体信号通路、甲状腺激素信号通路、NOD样受体信号通路、VEGF信号通路、神经营养因子信号通路、细胞色素P450对异生素的代谢、丙型肝炎、Toll样受体信号通路、细胞周期、MAPK信号通路、NF-κB信号通路、B细胞受体信号通路。此外，我们还发现一些不重合的信号，如截断法药物与P53信号通路相关，逆挽法药物与PPAR信号通路相关。

表2 截断法、逆挽法药物靶点共同参与的KEGG信号通路

3 讨论

2019年《慢加急性肝衰竭中医临床指南》提出截断逆挽法是抢救肝衰竭成功的关键治法。截断法包括清热解毒、凉血化瘀、通腑等，逆挽法包括滋肝、健脾、温阳、补肾等。钱英教授将截断法和逆挽法相结合创制截断逆挽方治疗慢性重型肝炎，疗效较好[3]。本团队在基础研究中发现，截断逆挽方能够降低慢加急性肝衰竭大鼠的死亡率、血清转氨酶水平，抑制血清炎症因子水平、细胞凋亡并促进细胞代偿性增殖[5-9]，其具体药理机制可能涉及E2F1、JNK及线粒体凋亡等多个信号。

本研究发现截断逆挽方中截断法和逆挽法药物有6个活性成分的重合，共对应118个靶点，占全方活性成分对应靶点的77.63%，表明从活性成分的角度解读截断法和逆挽法并非绝对保守。同时，全方成分在不同的靶点上具有协同作用， PTGS2、NOS2、NOS3均与氧化应激有关。临床研究显示，ACLF患者会出现系统性的氧化应激反应，这种现象可被检测循环中白蛋白的氧化还原状态所证实[10]。因此我们认为截断逆挽方可能具有抗氧化的药理活性。有学者提出“三重打击学说”阐释肝衰竭的发病机制，即肝组织在肝衰竭发生过程中依次经受了免疫损伤、缺血缺氧和内毒素血症等三重打击[11]。本研究显示截断逆挽方可正调控活性氧的代谢过程，对缺氧的反应、正调控细胞增殖、对有毒物质的反应、负调控凋亡过程、炎症反应等生物学过程也有显著富集，说明截断逆挽方在对抗肝衰竭的三重打击中均具有一定的药理活性。值得注意的是，有研究认为ACLF从发病到进展成肝衰竭之间有过渡时间窗，此阶段以免疫应答过激为主要免疫学特点，若给予积极有效的干预，部分患者病情可得到逆转[10]，这与钱英教授提出的截断法不谋而合。实际上，免疫细胞和细胞因子参与了ACLF的全过程，早期处于免疫过度激活状态，造成肝组织免疫性损伤，并形成系统性炎症反应综合征，随后又处于抑制状态，增加感染风险，甚至出现脓毒血症。因此，未来对于截断逆挽方抗ACLF药理作用的研究可围绕免疫相关靶点展开。

本研究利用String数据库对截断法、逆挽法药物靶点蛋白形成的PPI网络进行研究，发现IL6、VEGFA、TP53、TNF、MAPK1等靶点在两个PPI网络中具有相近的拓扑排序，表明截断法和逆挽法在某些方面具有协同作用。VEFGA与肝再生相关，IL6、TNF及MAPK1是炎症反应的重要活性分子，TP53与肝细胞凋亡相关，均具有抗ACLF的潜在作用。而BCL2、THBD和TOP2A在两个PPI中重要程度有所差异，可能是理解截断法和逆挽法各自特点的关键靶点。KEGG信号通路富集分析发现截断法和逆挽法在多条信号通路上具有协同作用，与免疫反应相关，包括TNF信号通路、T细胞受体信号通路、NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路、MAPK信号通路、NF-κB信号通路、B细胞受体信号通路等。对这些信号通路的调控能够显著影响肝衰竭的病情进展和病理进程，是治疗ACLF的潜在治疗靶点[12-15]。此外，截断法、逆挽法药物重合的信号通路还包括PI3K-Akt信号通路和细胞周期，前者能够抑制肝细胞凋亡，后者与肝细胞增殖有关[16,17]。神经活性配体-受体相互作用及神经营养因子信号通路等神经系统相关信号也被识别，对这些信号的调控可能改善ACLF相关的肝性脑病，保障大脑功能发挥正常。我们还发现了截断法药物的特有信号P53信号通路及逆挽法药物的特有信号PPAR信号通路；截断法中的17个药物活性成分可与PPAR受体相互作用(γ型和δ型)，文献支持截断法药物中的活性成分如槲皮素、常春藤皂甙元与PPAR-α、γ、δ型均存在一定程度的相互作用，活性成分异鼠李亭可与PPAR-α、γ型相互作用[18-21]。因此，截断法药物可能通过P53信号通路发挥抗凋亡作用，逆挽法可能具有多靶点作用于PPAR信号通路的作用，发挥维持脂质代谢功能、调节氧化应激和炎症反应的作用。

本研究还发现大部分截断逆挽方的化学成分口服利用度较低，因此中药复方存在与肠道菌群相互作用的可能，通过调节肠道菌群发挥抗ACLF的药理作用。这些均是本网络药理学研究的局限，需要未来的实验研究深入探讨。