RNA原位杂交技术在昆虫嗅觉相关基因定位中的应用

何丽云,王帆,林涛

(上饶师范学院 生命科学学院,江西 上饶 334001)

昆虫作为地球上种类最丰富的类群,进化出了非常精确和有效的嗅觉系统[1]。嗅觉介导昆虫完成寄主选择、配偶寻找、天敌躲避等行为,实现生存和繁衍[2－3]。通过研究昆虫的嗅觉感受的分子机制,阐明昆虫识别气味分子的方式,可为设计高效和特异性的农药提供分子模型。目前研究揭示,参与昆虫嗅觉感受的主要包括以下几类功能蛋白,气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)、化学感受蛋白(chemosensory protein,CSP)、气味受体(odorant receptor,OR)、离子型受体(ionotropic receptor,IR)、神经元膜蛋白(sensory neuron membrane protein,SNMP)和气味降解酶(odor degrading enzyme,ODE)等[4]。当环境中的气味分子经由昆虫触角或下颚须化学感器表面的孔道进入水溶性感器淋巴液(seneillar lymph)后,存在于感器内的OBP或CSP与气味分子结合,并将气味分子转运至嗅觉感受神经元膜周围,并激活OR或IR[3]。OR或IR接收气味信息后,即对气味信息的强度和反应时间进行初步的编码,将化学信号转换为电信号[5],并经嗅觉神经元传递到昆虫的中枢神经系统内。也有研究表明在这个过程中,SNMP在昆虫外周嗅觉系统的信号转导过程中也起到了重要作用[6]。当气味分子激活OR或IR后,感器内的ODE开始发挥作用,它将气味分子进行降解,这避免了化学信号持续地刺激嗅觉神经元,同时还减小了信号过饱和的影响[4,7]。嗅觉感器通过表达不同类型功能性蛋白,并选择性的与气味分子结合,这赋予了感器能够识别特异性气味分子的功能[7－8],因此通过探测不同感器中调控嗅觉相关蛋白的基因表达情况,能够为阐明不同感器的功能特点,为明确OR或IR对气味编码机制奠定基础。

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是一门新兴的分子细胞遗传学技术,是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性基因定位技术,具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可多重染色等特点,能够可视化的定位出基因在细胞水平的表达模式,被广泛的用于昆虫嗅觉相关基因在触角上的分布模式和不同基因之间的共定位研究[9－10],为阐明昆虫感受气味信息的分子机制提供了证据。通过综述荧光原位杂交技术的原理、实验方法及其在昆虫嗅觉相关蛋白基因组织定位中的应用,以期为可视化的研究昆虫嗅觉感受的分子机制提供参考。

1 荧光原位杂交技术的原理

荧光原位杂交技术是根据核酸分子碱基互补配对原理的实验技术。通过半抗原标记DNA或RNA作为探针,并与经过变性的单链核酸序列进行互补配对,再通过携带荧光基团的抗体去识别与探针耦联的半抗原,在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察目标序列在组织中的分布情况,进而实现定位靶标核酸序列的目标[11]。早期的原位杂交技术使用的是放射性元素对探针进行标记,然而这种标记方式存在诸多弊端,限制了原位杂交技术的应用。Rudkin等[12]首次利用荧光分子标记RNA探针,对果蝇的染色体基因进行定位分析,开创了非放射性标记的杂交技术。因荧光原位杂交技术克服了放射性探针检测周期长且危害人体健康的缺点,被广泛用于染色体的识别、DNA序列的定位和细胞内m RNA表达定位等[13]。

2 RNA原位杂交操作程序

2.1 探针制备

相比DNA探针而言,RNA探针因具有易获得、与m RNA结合更稳定、背景低等优势而被广泛应用[14]。目前,主要以RNA作为探针对昆虫触角中调控嗅觉相关蛋白的基因表达进行定位研究。RNA原位杂交技术的探针标记分为直接标记和间接标记两种方法。直接标记是将荧光分子直接标记在探针上;间接标记是先在RNA探针上连接半抗原物,再用经荧光物质标记的抗体与探针上的半抗原特异性结合进行检测目标RNA。由于昆虫触角中嗅觉相关基因表达量各异,对于低表达量的蛋白(如OR),常采用间接标记法放大荧光信号,提高检测的灵敏度[9]。在间接标记法中,最常用的半抗原是生物素(biotin)和地高辛(digoxigenin,Dig)。生物素是一种维生素,其与天然配体亲和素(avidin)或链霉亲和素(streptavidin,SA)具有极高的亲和力。地高辛是从洋地黄类植物中提取的类固醇物质,因大多数生物体内不含该物质,因此采用地高辛标记的探针对原位杂交检测目标RNA时,无背景干扰问题[15]。

在制备RNA原位杂交探针时,主要采用体外转录的方法获得探针。首先将编码昆虫的嗅觉相关蛋白目标基因克隆至载体的多克隆位点上,其中目标基因的两侧须含有T7和SP6或T7和T3的RNA聚合酶启动子序列。之后,利用合适的限制性内切酶将载体线性化,以获得体外转录的模板。再应用T7和SP6或T7和T3 RNA聚合酶及带有地高辛标记的三磷酸尿苷(uridine triphosphate,UTP)进行体外转录获得含有地高辛标记的正义和反义RNA探针。在合成探针后一般会用碳酸盐缓冲液60℃水解若干分钟将RNA探针进行水解以获得目标长度。不同嗅觉基因的探针长度各异,一般探针的长度为200～800 bp[16－18]。此外,也有通过化学合成法将荧光分子连接至探针上,并直接用于原位杂交检测目标RNA。如Lin等[19]将花氰染料(Cy3)荧光分子直接连接在探针的5′端,并用于检测斜纹夜蛾Spodopteralitura触角上的受体SlituOR3。然而在探针上直接标记荧光分子时,杂交后,探针的信号较弱,且荧光易猝灭和杂交后片子无法长久保存等问题而限制了其使用范围。体外转录法合成RNA原位杂交探针是目前研究昆虫嗅觉相关蛋白基因定位中最常用的方法。首先,通过体外转录合成的探针,其转录和终止均可有效定位在精确位置,起始于目的DNA上游的启动子,终止于限制性内切酶酶切末端。其次,以线性化的载体为模板经过反复转录可以合成数量很多的RNA探针。最后合成的RNA杂交探针活性高,可以检测组织中表达量相对较低的mRNA,并与之形成稳定的二聚体[9]。

2.2 杂交样品的制备

在制备原位杂交试验样品时,常用的检测材料是触角的冷冻切片和全触角(whole mount)。制备触角冷冻切片样品时,将触角从昆虫的头部切下,立即用包埋剂进行包埋,将样品放于－24℃～－20℃中冷冻,待冷冻后进行固定并进行切片,每个切片的厚度在8～15μm。之后将切片固定于载玻片上,解冻并自然风干,随后将切片置于－80℃环境中保存备用或直接进行固定处理。全触角的原位杂交时,将整个触角从新鲜的昆虫头部解剖下来,并立即置于固定剂中固定。值得注意的是,在制备杂交样品时,需要格外注意RNase对样品和RNA探针的降解,因此除要严格地对试剂、耗材进行去除RNase的操作外,还应该保持实验环境的洁净以减少与RNase的接触。材料固定的质量直接影响组织中mRNA的完整性和原位杂交结果的可靠性。因此,为获得较好的结果,应使材料获得充分的固定。触角原位杂交实验中通常采用的固定剂是4%的多聚甲醛。整个触角和触角冷冻切片样品固定的时间各不相同,冷冻切片样品只需在4℃下固定20～30 min,而整个触角的固定则时间更长,6℃下需要固定20～24 h。

2.3 RNA原位杂交

昆虫触角m RNA的原位杂交主要包括预杂交和杂交处理两个过程。预杂交可以使探针更接近靶标RNA,同时也可以降低非特异性杂交背景。预杂交的溶液中不包含RNA探针,其他组分与杂交液相同。杂交液的组分在不同的研究中也有变化,但都包含了甲酰胺、柠檬酸钠缓冲液、硫酸葡聚糖和RNA传递体(如酵母t RNA)等[9]。高浓度的柠檬酸钠缓冲液促进整个溶液体系的稳定,甲酰胺可以降低杂交所需的温度,硫酸葡聚糖可以析出杂交液中的水分进而增加探针的浓度以提高杂交的效率,RNA传递体可以使探针在整个触角中分布均匀。另外,还有一些成分如Denhardt's溶液,吐温20、Chaps去污剂和EDTA加入杂交液中,其中Denhardt’s溶液和去污剂的用途是减少探针的非特异性杂交,EDTA可增强组织通透性有利于核酸探针穿透进入组织,同时,EDTA也可保护核酸不受浓度、温度等条件影响,也不会引起细胞结构的破坏。通常在预杂交前需要利用HCl和Triton X－100处理触角样品。其中盐酸处理是为了打断mRNA的二级结构,分离多核糖体,Triton X－100是为了增加组织细胞的通透性有利于探针等大分子进入细胞。

杂交处理过程中,杂交结果的特异性和敏感性与杂交的条件密切相关。杂交条件主要包含杂交的温度、探针的浓度和杂交持续的时间等参数。常用的杂交温度为55℃,但其范围可以为37℃～65℃。虽然杂交信号在几个小时内便可检测到,但常用的杂交时间为48～72 h[9]。探针的浓度对杂交效果有明显影响,浓度过低则使得信号微弱,难以检测到靶标RNA,浓度过高则容易提高背景,同时也造成探针浪费。因此,在杂交前需要对合成的探针浓度进行定量分析以确定最终合适的浓度。预杂交与杂交处理的温度相同,预杂交的时间范围为6～72 h。

2.4 杂交后的处理

昆虫触角m RNA原位杂交后的处理包括对样品的洗涤、抗体杂交和显色观察等。杂交结束后需对非特异性结合的探针进行洗涤,同时利用单链核酸酶进行消化去除多余的探针。常规的洗涤条件为用含有Triton X－100的柠檬酸钠缓冲液在60℃下冲洗数次。随后是利用特异性抗体识别探针上所标记的半抗原分子,进行免疫组织化学标记。免疫标记前需要对样品进行封闭处理,目的是防止抗体的非特异性结合而出现假阳性的结果,同时可以降低背景的干扰。例如利用生物素或地高辛标记的探针标记的样品,常放置在含Triton X－100的Tris－HCl缓冲盐溶液中进行6℃封闭。封闭后再进行抗体孵育反应,通常是在保湿容器中进行6℃孵育48 h。抗体结合后,在含吐温20的缓冲液中进行数次的洗涤,以去除多余的抗体。免疫染色过程中,抗地高辛的抗体(anti－dioxigenin)或抗生物素的抗体通常会偶联辣根过氧化酶(horse radish poxidase,HRP)或碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatase,AP)。这两种酶可以催化底物而显色,实现目标基因的标记。HRP可催化底物3,3－二氨基联苯胺四盐酸(3,3－diaminobenzidine tertrahydrochloride,DAB)形成棕色的沉淀,进而达到显色目的,该反应灵敏度高、特异性好,生成的显色产物不溶于乙醇,故可在DAB显色后继续使用溶于乙醇的染料进行双染色。AP和底物对甲苯胺兰(5－bromo－4－chloro－3－indolyl phosphate,BCIP)/氯化硝基四氮唑蓝(nitroblue tetrazolium chloride,NBT)构成的显色系统,在AP的催化下,BCIP会被水解,其产物会和NBT发生反应,形成不溶性的深蓝色至蓝紫色沉淀。HRP和AP的底物显色反应后可使用普通的显微镜镜检,且显色可永久保留。该检测手段能满足大部分研究的灵敏度需求。另外,AP还有一种用于荧光检测的底物HNPP/Fast Red TR(罗氏公司),可用于激光共聚焦显微镜下检测杂交信号,可提高荧光检测的灵敏度。

3 RNA原位杂交在昆虫嗅觉相关基因定位中的应用

3.1 在OBP、CSP和ODE等基因定位中的应用

昆虫OBP和CSP蛋白均参与气味分子的运输,在气味信号转导过程中起重要作用。Missbach等[20]通过体外聚合酶转录系统制备出地高辛标记的RNA探针,与石蛃Lepismachilisy－signata触角进行原位杂交,并通过HNPP/Fast Red TR显色系统,分别标记出Lsig OBP2和LsigOBP5蛋白主要表达在触角端部和中部的锥形感器基部细胞中。Jacquin－Joly等[21]通过体外转录合成一个600 bp地高辛标记的RNA探针,与甘蓝夜蛾Mamestrabrassicae触角进行杂交,通过NBT/BCIP显色系统,发现化学感受蛋白CSPMbra A6主要表达在触角长毛型感器的基部。Schultze等利用该技术成功的定位了冈比亚按蚊Anophelesgambiae雌成虫的9个OBPs在触角中的表达区域,它们主要分布在触角鞭节的5～13个节段内,但每种OBP的分布模式不同[16,22－23]。除成虫外,原位杂交发现棉贪夜蛾Spodopteralittoralis的幼虫也会表达专门与性信息素结合的蛋白[10]。昆虫的ODE能够快速降解气味物质,例如酯酶能够快速使日本金龟子Popilliajaponica的性信息素失去活性[24]。RNA原位杂交结果表明,ODE表达于昆虫触角嗅觉感器的基部,如甘蓝夜蛾的酯酶Mbra－EST表达于雌雄成虫触角的长毛型感器和短毛型感器中[25],棉贪夜蛾的羧酸酯酶Sl-CXE10主要表达在雄虫触角嗅觉感器基部和血淋巴液中,另一种酯酶Slit－EST则表达于雄虫触角毛型感器的基部[26－27]。除酯酶外,有研究指出昆虫触角中的醛氧化酶、醛脱氢酶和谷胱甘肽转移酶也可能参与气味的降解过程,但其分布位置尚不完全清楚[7]。通过RNA原位杂交技术,Merlin等[28]可视化地提供甘蓝夜蛾触角中的醛脱氢酶Mbra－AOX选择性的表达于嗅觉感器中,表明其可能参与性信息素或植物挥发物中醛类的降解。

3.2 在OR、IR和SNMP等基因定位中的应用

昆虫的气味受体分布于触角嗅觉感器内神经元的树突膜上,包含气味共受体(odorant receptor coreceptor,Orco)和传统气味受体OR两种类型。其中Orco是昆虫非典型气味受体,本身不与气味分子结合,但能够提高OR对气味的反应能力,因此可以利用是否表达Orco来间接判断感器是否参与气味的识别。如赵慧婷等[29]通过RNA原位杂交实验发现中华蜜蜂Apisceranacerana的Orco主要在触角上的毛型感器和板型感器基部表达,间接表明两种感器均属于嗅觉感器。类似的,通过定位分析发现飞蝗Locustamigratoria与沙漠蝗Schistocercagregaria的Orco主要在触角的毛形感器和锥形感器中表达,但不表达于刺形和腔锥形感器中[30]。传统气味受体OR,具有丰富的多样性,能够选择性的与不同类型气味结合[7]。RNA原位杂交研究表明棉贪夜蛾气味受体Slit OR6主要表达在雄虫触角的长毛形感器中,而雌虫触角中并不表达,结合功能研究表明该气味受体主要感知雌虫释放的性信息素[31]。同样的家蚕Bombyx mori的气味受体Bm OR1定位于长毛型感器内部的神经元中,能够特异性的识别雌虫释放的性信息素[32]。除OR外,昆虫嗅觉感器中的神经元会表达一些离子型的受体IR,同样能够对不同气味分子产生反应,通过RNA原位杂交研究表明,IR主要表达于腔锥型感器内的神经元中[33],其对气味的反应谱与OR存在差异[34－35]。通过cDNA文库筛选及RNA原位杂交发现昆虫中存在SNMP蛋白[7,36],它主要表达于毛型和锥形两种感器内的神经元或支持细胞中,并参与信号的转导[37－38]。例如Sun等[17]应用该技术定位出茶尺蠖Ectropisobliqua成虫2种神经元膜蛋白EoblSNMP1和EoblSNMP2在触角中的表达位置,其中EoblSNMP1仅在部分I型毛形感器的基部表达,而EoblSNMP2在几乎所有的I型毛形感器和锥形感器中都有表达。

3.3 嗅觉相关基因的共定位研究

嗅觉感受是多蛋白质相互作用的过程,RNA原位杂交为阐明嗅觉蛋白互作提供了最直接的可视化证据。通过分别对地高辛和生物素两种半抗原来标记OR和OBP探针,并与冈比亚按蚊触角杂交表明,气味结合蛋白AgOBP47分别与气味受体Ag OR11、AgOR13和Ag OR55共定位于触角同一感器细胞内[16],AgOBP1与AgOR1、AgOBP4与AgOR2共定位于同一感器细胞中[22]。类似的蝗虫气味结合蛋白Obp1与气味受体OR2共定位于下颚须的锥形感器中,Obp2a与IR8a共定位于下颚须的刺形感器中[39]。Krieger等[40]应用原位杂交发现烟芽叶蛾Heliothisvirescens两个受体HR11和HR13与性信息素结合蛋白PBP共定位于长毛型感器基部,并且这两种受体同时成对出现,推测这两个受体是感知雌虫释放的性信息素中的不同组分。冬尺蠖Operophterabrumata的Orco广泛表达于嗅觉相关感器内,并且在部分长毛型感器的基部Orco与Obru OR1存在共定位[41]。在沙漠蝗Schistocercagregaria中触角中表达IR的细胞与表达的Orco基因的细胞并不重叠,这说明IR与OR识别不同类型气味信息[42]。通过这些研究能够为明确昆虫嗅觉相关蛋白之间的互作方式提供可视化的证据,同时也为进一步研究嗅觉感受的分子机制指出具体的方向。

4 小结及展望

荧光原位杂交技术以其灵敏度高、特异性强、探针可通过体外反转录获得等优势被广泛用于基因表达定位中。近20年来,该技术先后被用于多种昆虫的嗅觉蛋白定位研究中,提供的可视化的研究结果为阐明嗅觉感受的分子机制提供了重要的基础。然而,该技术在进行定位研究中并不容易实现,其要求实验环境无RNA酶污染、RNA探针在触角内部的渗透性强,背景噪声低及杂交后荧光信号不猝灭等。此外,由于不同昆虫触角内的嗅觉相关基因表达量各不相同,因此需要反复摸索相应的探针浓度,过高会导致背景染色强,容易出现假阳性,过低则容易导致信号难以检出。针对RNA在触角内低表达量的问题,Xu等[9]利用酪酰胺信号放大(tyramide signal amplification,TSA)技术,使探针标记后的细胞周围产生大量的荧光信号,实现了极微量的RNA的可视化定位。随着成像技术和基因编辑技术等的发展与应用,相信未来会有更多新的技术手段被应用于荧光原位杂交中,必将极大地推动该技术在昆虫嗅觉相关基因定位应用中的发展。