具有聚集诱导发光效应的荧光探针在生物医学中的应用*

陈宇航，李潇

(1.南方医科大学口腔医学院，广州 510515；2.南部战区总医院口腔科，广州 510100)

1 引 言

一直以来，荧光探针都是实验研究领域的热点。但传统的荧光探针在水中容易发生聚集，出现荧光猝灭的现象，即聚集荧光猝灭效应(aggregation caused quenching，ACQ)，因此无法达到长期的成像和信号追踪效果[1-2]。而在2001年，唐本忠院士研究小组发现了一种噻咯衍生物在薄层层析板上不发光，但随着溶剂挥发，发光“无中生有”地大幅增强。同样，当这类分子溶解于良溶剂中处于单分子态时，在紫外光激发下几乎不发荧光，而在加入水等不良溶剂生成聚集体后，却发出强烈地荧光。据此，该课题组提出了聚集诱导发光(aggregation induced emission，AIE)这一光物理领域的新概念，克服了聚集荧光猝灭的瓶颈，实现了一场关于荧光探针的历史变革[3-4]。由于AIE效应的荧光探针克服了传统荧光分子在浓溶液中会出现聚集导致荧光猝灭的弊端，目前受到广泛的关注[4]。

2 荧光探针原理及类型

2.1 概述

荧光探针是化学传感技术领域在20世纪末的一项重大发现，它使得分子识别的方式有了飞跃性的进步。经过大量研究及应用，荧光探针已在发光材料合成、荧光传感、细胞及组织成像等方面广泛应用[5]。荧光探针由荧光团(发光基团，Fluorophore) 、识别基团(受体，Receptor) 和连接臂(桥联基团)3个部分组成，而其机理可大致归纳为四个模型：螯合诱导增强荧光(CHEF)，分子内电荷转移(ICT)，光诱导电子转移(PET)和聚集诱导发光(AIE)[6]。其中基于聚集诱导发光机理的荧光探针是我们主要的讨论内容。

2.2 AIE荧光探针的原理

具有聚集诱导发光(AIE)性能的荧光探针具有明显的优势，是目前研究的前沿。聚集诱导发光与几种机制通路有关，包括分子内运动的限制(restriction of Intramolecular Motions， RIM)、J聚集形成(J-aggregate formation, JAF)、激发态分子内质子转移(excited-state intramolecular proton transfer, ESIPT)等。其中RIM是目前研究发现的引起AIE效应的主要原因。因此，本研究以RIM为例，对AIE效应形成的原理机制进行简要介绍。RIM的机理模型[7]表示，在稀溶液中，AIE分子内部的一些基团有着活跃的相对运动(例如振动和转动)，处于激发态的分子通过振转形式将光能以热能等形式消耗，以光形式输出能量的比例变小，荧光效率因而降低；而当这些分子聚集在一起时，分子内部运动受到限制，运动热能的比例降低，光输出形式的能量比例增加，表现出荧光增强的现象。具体来说，分子内运动包括旋转和振动，有较大一部分的AIE分子都是以限制分子内旋转运动为基础的。比如，常见的荧光分子四苯基乙烯(Tetraphenylethylene, TPE)的结构由四个苯环通过单键与中心的乙烯杆相连。苯环可以相对乙烯定子产生很大的自由旋转或扭转。在稀溶液中， TPE的孤立分子可以进行主动的分子内旋转；但在聚合态时由于物理约束，分子内旋转受到限制，从而打开了辐射衰变通道[8]。除了分子内旋转运动，也有AIE分子主要进行的是分子内振动。例如10,10'，11,11'-四氢-5,5'-二苯并[a, d]环亚萘基(10,10′,11,11′-tetrahydro-5,5′-bidibenzo[a, d]annulenylidene，THBA)分子内并不存在可旋转的基团，但它由两个可伸缩的部分组成，其中每个部分的两个苯环由可弯曲的弹性部分连接。THBA的分子内振动在某种意义上类似于扇贝的呼吸运动，在聚集态形成时，由于空间限制约束了分子内振动，辐射衰变通道被打开，使THBA在聚合状态下发射荧光。而JAF机理是指在溶液、添加剂或浓度的影响下，一种染料的吸收带转移到一个更长的波长(红移)，并增加清晰度(更高的吸收系数)[8]。而ESIPT是一种由分子内氢键介导的极快的光诱导质子转移过程。不同的理论各有其证据与适用性，而RIM可以解释目前为止绝大部分AIE系统的机制[9]。

2.3 AIE荧光探针的类型

AIE荧光探针的分类方式多种多样，包括根据荧光基团分子构成的分类，根据应用方面的分类，以及AIE基团在聚合物中发挥的功能分类[10]等。荧光基团的分子构成可分为六苯基噻咯(Hexaphenylthiazole，HPS)类，四苯基乙烯(TPE)类，三苯胺(triphenylamine， TPA)类，二苯基乙烯基蒽 (Stilbene anthracene，DSA)类探针等。以四苯基乙烯(TPE)为例[11]，TPE由单键连接四个苯环，从而获得较为自由的运动，其AIE原理可以用上述提到的RIM机理模型来解释。目前多采用钯催化交叉偶合反应等方法，将TPE基团与生物染料结合在一起。其AIE的表现高度依赖于连接在染料核上的TPE基团的位置和数量。Baysec等[12]将TPE基团结合于2,6-二溴生物染料的2,6-位置，能有效抑制ACQ，并增强AIE聚集诱导的活性。而三苯胺(TPA)基团富含电子，具有较大的空间位阻、超共轭电子效应以及较高的空穴迁移率，可以和许多生物染料形成强大的电子间相互作用，发出强的荧光。Jiang等[13]通过三苯胺(TPA)与咪唑啉酮结构单元合成了脂滴成像的荧光传感器，展现出了202 nm的大斯托克斯位移和213 GM的大双光子吸收截面。

根据应用方面，可将AIE荧光探针分为用于光电设备的制造，荧光传感(离子探测，pH，机械刺激，温度刺激，光源刺激等)，生物成像(细胞膜染色，细胞质染色，线粒体染色等)以及医学应用(监控药物运输，结合抗菌能力，肿瘤成像及治疗等)。下面主要对AIE荧光探针的离子探测、生物成像及医学应用三个方面进行讨论。

3 AIE荧光探针的应用

3.1 离子探测

不同的离子在实验研究中扮演着不同角色。如，铜离子(Cu2+)和三价铁离子(Fe3+)在生理学和病理学反应中承担着重要的功能，比如氧化还原反应，酶催化反应，氧气运输及电子转运等。另外也有因具有毒性而需要监控其浓度的离子，如汞离子(Hg2+)。以下将对AIE聚合物在离子检测及生物分子的传感方面进行讨论。

3.1.1Ca2+的检测 Gao等[14]通过将带负电荷的亚氨基二乙酸基团作为螯合配体并入水杨苷(SA)中，开发出一种基于AIE效应的荧光探针SA-4CO2Na。在没有Ca2+离子的情况下，探针SA-4CO2Na可以分散在水溶液中，只发出非常微弱的荧光；而在Ca2+离子存在的情况下，探针可以通过亚氨基二乙酸基团与Ca2+之间的静电和螯合作用形成高发射性纤化合体。它可以选择性地探测毫克分子级别(1.0～1.4 mM)的钙离子，并发出亮光，并区分血中钙含量过高(1.4～3.0 mM)和正常(1.0～1.4 mM)两种等级。

3.1.2Hg2+的检测 有研究发现，汞离子可以与硫脲、硫酰胺、硫酮等物质发生反应，可以在化学上识别出汞促进脱硫机理中的Hg2+。王彬彬等[15]以喹喔啉为基础开发了一种新型AIE聚合物，二苯基喹喔啉分子。他们通过将1，3—二硫基—2—硫酮部分与2，3—二苯基喹喔啉的核结合，利用二苯基喹喔啉核的AIE特性以及1，3—二硫基—2—硫酮部分与Hg2+的反应活性，建立了一个在水溶液中对Hg2+具有特异刺激荧光感应功能的分子。该化合物表现出对Hg2+的良好特异选择性，从而区分其他常见的重金属离子。

3.1.3Cu2+与Fe3+的检测 Amitha等[16]以荧光素和4—硝基邻苯二腈为原料，经芳香基硝基取代反应合成了一种新型的4,4—荧光氧基双苯二腈FPN。FPN的结构由邻苯二腈-荧光-邻苯二腈、受体-给体-受体、AD-A型组成，该分子选择性地表现出对Fe3+离子的荧光关闭行为，其检测限(Limit of Detection, LOD)为14.49 μM。Jiang等[17]开发了一种能同时检测Cu2+、Fe3+和半胱氨酸的AIE聚合物。他们通过纳米沉淀法形成了一种AIE分子的凝聚体，使其成为一种对Cu2+、Fe3+和半胱氨酸这三种物质具有开关效应的荧光化学传感器。实验表明，大部分被测金属离子仅引起轻微的荧光猝灭，而Cu2+和Fe3+的猝灭荧光强度显著。

3.1.4Ir3+的检测 光敏剂(PS)产生纯态氧(1O2)的能力是光动力治疗(photodynamic therapy , PDT)的关键。过渡金属配合物如铱(Ir3+)配合物由于其理想的光物理性质、较大的斯托克斯位移及高的1O2生成能力，常被用作有效的光敏剂。Zhang等[18]设计并合成了一系列以具有AIE特性的三苯胺(TPA)基团为核心，并含有不同数量Ir3+中心(单核、二核和三核)的红色聚集诱导发射(AIE) 铱配合物以及相应的纳米粒子。与纯的铱配合物相比，具有AIE效应的纳米粒子具有更长的长激发寿命、更高的1O2生成能力、更好的生物相容性以及更强的细胞摄取能力。

3.2 生物成像

具有AIE效应的荧光探针由于其在成像及监控生物及其生物系统的各种反应方面具有出色的能力，近年来愈发受到关注[19]。我们将从荧光分子与细胞染色的不同部位分类，分别介绍细胞膜染色，细胞质染色，线粒体染色等新型的荧光探针。

3.2.1细胞膜染色 细胞膜(Cytomembrane)是细胞维持稳定代谢的胞内环境的重要屏障，同时它还行使调节和选择物质进出细胞的功能，并调控细胞的识别和信号传导。Wang等[20]报道了一种新型的水溶性AIE材料，名为TTVP，是一种由三苯胺基团、噻吩片段及碳碳双键组成的DA型化合物。它无需经过洗涤过程便超快速地对分析物进行着色，并特异性地作用于细胞膜，发出红外光谱区域的荧光。

3.2.2细胞核染色 细胞核(Nucleus)里储存着大量的细胞遗传物质，对其进行染色成像在生物医学的研究及临床医学的应用都具有重要的意义。Yu等[21]开发出一种具有AIE效应的细胞核染色剂，它是一种α—氰基二苯乙烯衍生物(ASCP) ，并通过研究发现该分子是一种良好的细胞核染色剂。不会破坏细胞的完整性，可实现对细胞的成像，并进行长期的示踪。Lv等[22]设计并合成了一种对细胞核具有特异性的AIE荧光探针，与市售药物DAPI(4',6—二脒基—2—苯基吲哚)相比，该荧光探针有较大的斯托克斯位移(175 nm)和光稳定性，与细胞核更亲近。进一步的实验表明，该探针可以通过染色癌细胞核高度区分正常细胞与癌细胞，并且能进一步用于长时间的癌症细胞核的成像及追踪。

3.2.3线粒体染色 线粒体是一种半自主细胞器，能产生细胞的能量货币——腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)。能够选择性地标记细胞内线粒体并产生荧光的探针是监控细胞凋亡和退化的强有力的方法[21]。Leung等[23]研究了一种用线粒体靶向识别基团修饰的具有AIE效应的荧光探针。他们以四苯基乙烯(TPE)为基础，将其与三苯基磷(TPP)组合。具体合成过程是先由McMurry偶联反应合成具有AIE效应的TPE核，然后与三苯基膦的后续反应连接形成TPE-TPP。该合成物TPE-TPP能特异性地对活细胞内的线粒体标记荧光，具有出色的光稳定性。

3.2.4脂滴染色 脂滴即脂质液滴，与各种生理过程有着密切的联系，其数量及活动都与许多疾病(如癌症)相关联。Wang等[24]通过简单的合成和提纯操作做出了两种简单的荧光分子(FAS和DPAS)，这两种分子都展现了聚集诱导发光(AIE)和激发态分子内质子转移(ESIPT)特性。具有良好生物相容性地FAS和DPAS都能特异性地在活细胞的脂滴中累积，并在聚集态分别发出亮橙色和黄色的光。

3.2.5植物细胞染色 AIE发光物在农业，植物工程学中也有应用。Wang等[25]以一种化学物异长叶烷酮为基础，设计了五种六羟喹唑啉—2—胺基衍生物，成功合成后展示出了良好的AIE特性。这些衍生物可以在固态时呈现出增强的荧光强度，并且能够特异性地对锌离子进行荧光成像。他们进一步地用蜀葵植物细胞作为参照，成功地对蜀葵花粉粒内的锌离子成像。

3.3 医学应用

与许多传统的有机染料或探针相比，AIE效应的荧光探针对光漂白的抗性强，由于其以聚合物形式释放，因此效率更高，且一般具有良好的生物相容性，细胞毒性较小。如今，关于具有AIE效应的荧光探针在医学方面的应用研究已非常广泛，各种能对离子、细胞结构进行荧光成像的分子被报道出来。除此之外，也有许多研究将重点放在了荧光探针的其他医学功能方面，如监控药物的运输与释放、结合抗菌药物、肿瘤成像及治疗等，有的AIE荧光物还同时兼具上述的几种医学功能。比如，一种利福平负载的AIE载体[26]被证实可定位肉芽肿，并在感染的早期阶段发出荧光信号，达到早期诊断结核病的目的。而在抗菌方面，许多学者将AIE荧光基团与其他抗菌物相结合，合成了新型的AIE抗菌材料[27]，通过不同的机制杀灭细菌[28-30]。同时，AIE荧光探针在抗肿瘤治疗方面也有广泛的应用[31-34]。另外，还有涉及其他领域的应用，如在口腔牙周医学领域中，构建AIE荧光探针用于检测牙菌斑生物膜[35]。

3.3.1监控药物的运输及释放 Li等[36]开发了一种用于药物运输的新型的磷酸分子，1,2—二(4—硼酸基苯)—1,2—二苯乙烯(PATPE)，它在DMSO-H2O溶液中，以预备过的四苯基乙烯和其酯衍生物为基，展现出AIE的效应。接着他们将该PATPE分子以一步凝结法与羟基磷灰石组装起来，形成一个椭圆型中空的纳米胶囊。该纳米胶囊在紫外线下发出强的蓝光，可以进一步用于监控药物的运输。他们主要是以布洛芬为模型药物进行了模拟，并得出了该纳米胶囊通过荧光强度的改变，能有效显示药物释放的整个过程。

3.3.2抗菌性能与AIE荧光效应的结合 Zheng等[37]开发了一种既具有抗菌性能，又有AIE效应的混合物，是以共价结合的形式将抗菌金纳米簇(Au NCs)和达托霉素(Dap)结合在一起的发光物。他们通过Dap的羧基与湿分子的氨基之间的强共价键(酰胺)，将Dap与Au—NCs共价结合，制备了Dap—AuDAMP NCs化合物。进一步的研究显示，由于AIE效应，这种以4,6—二氨基—2—巯基嘧啶介导的荧光离子可以提供最大约4倍的增强荧光。

3.3.3AIE荧光探针在肿瘤成像及治疗的应用 与恶性肿瘤的抗争一直以来都是医学界的重要课题。Shao等[38]开发一种能对肿瘤细胞进行成像的有机喹啉-丙二嗪(QM)纳米探针，这是一种可由远红外和近红外光激发产生AIE效应的具有良好生物相容性并能应用于细胞示踪的荧光探针。他们设计出了以QM为基础的几种衍生物，并以QM-2和QM-5为例，经过实验得出其对于正常细胞及肿瘤细胞都表现出低毒性的结果，并且经过24 h与HeLa细胞的孵育后表现出亮的荧光。而Wang等[39]通过将AIE荧光基团1,2—二(4—羟苯基)1,2—二苯乙烯与非变位的聚乙炔聚醚腈(polyarylene ether nitrile, PEN)的结合获得具有AIE效应的PEN。将此AIE-PEN交联到具有良好生物相容性的水溶性荧光纳米球中，可以成功对癌细胞进行生物成像。Zhang等[40]开发了一种用于肿瘤光动力学治疗的AIE光敏剂，它是一种聚合物胶束，由包含水杨醛的两亲性聚合物的自组装形成，将其命名为AIE-M。它可以在溶液中释放光辐射并产生活性氧，经由肿瘤细胞摄取后，特异性地先逗留在细胞膜上，接着显著地在细胞线粒体中停留，从而释放出荧光效应的同时产生活性氧，使肿瘤细胞凋亡及坏死。它在无光照时可忽略的毒性以及有光照时的光毒性使其在影像指导的肿瘤光动力学治疗(PDT)中具有让人期待的潜力。

3.3.4探测牙菌斑生物膜 于娜等[35]基于TPE特殊的发光机制构建了一种具备荧光信号“开关”功能的牙菌斑生物膜检测探针TR4。该探针的荧光部分由四苯基乙烯(tetraphenylethylene, TPE)组成，并与棕榈酸和亲水多肽R4共价连接形成，分别起荧光生发、粒子组装与静电吸附的作用，通过调节TPE的聚集状态实现荧光的开关。TR4中的多肽R4具有较强的正电荷，可以引导TR4通过静电相互作用与表面带有负电荷的牙菌斑生物膜结合。结合过程会屏蔽TR4分子的正电荷，使TR4发生自组装形成纳米粒子，诱导TPE分子的聚集发光。可实现对牙菌斑生物膜的检测，是一种既快速又便捷的检测手段。

4 总结与展望

由于AIE分子与传统的其他荧光染料相比，能克服ACQ效应，研究者能积极利用聚合过程而不必考虑如何阻止荧光物形成聚集态，使荧光的应用范围得以扩展。AIE荧光探针在生物医学方面应用广泛，包括发挥荧光传感功能、细胞成像、药物运输及治疗等方面。目前有许多AIE分子会随外界刺激或环境的变化(如pH、温度、溶液中离子浓度等)而发生荧光的变化，与分析物存在“超增强”效应，因此，可以作为探测离子浓度变化的敏感探针应用；由于AIE分子大多具有良好的生物相容性，通过对荧光基团的修饰，可以作为敏感且成像清晰的细胞染料，目前也有许多研究设计了各种用于细胞核、细胞膜等染色的AIE荧光物；此外，还有研究者对于AIE探针在其他医学方面的研究扩展，利用不同的策略(如：与抗菌药物的化学键进行共价结合、利用羟基磷灰石等大分子组装等)组建了不同的AIE分子，实现了其在肿瘤细胞的示踪、肿瘤光动力治疗、药物运输与释放的荧光显像等方面的应用。

尽管目前AIE分子已有了较成熟的研究与应用，但仍然存在一些未解决的问题。一方面，开发及应用能吸收及发射长波长的AIE分子仍具挑战；另一方面，目前常见的AIE探针分子在水溶性方面仍有缺陷。随着Wang等[20]开发的一种具有水溶性的AIE分子TTVP的出现，如何获得具有良好水溶性的AIE分子的方法或许会成为荧光成像技术的研究方向之一。自2001年唐本忠院士研究小组发现了AIE现象以来，AIE荧光探针已在实验研究的许多方面得到应用，而其更深层的机制和更独特的优势仍值得我们进一步去发掘。